流式细胞仪(Flow Cytometer)原理及应用-12.4
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14 15 16 17
7 recip 9-22 9-12
Chromomycin A3
（GC）
结束语
流式细胞术是一种应用范围极广、灵活性很 强、技术含量较高、具有众多开发潜能、富有挑 战性的技术，需要掌握很多交叉学科知识，在科 研领域灵活运用这项技术，报告最科学、最真实 的客观数据，是我们的目标。
单参数直方图（Histogram）
二维等高图和密度图
Pseudo 3D Plot
3D Plot
便于数据统计 不同的细胞群 可以用不同的颜 色标记 主要表达方式
二维点图Dot Plot
光谱交叉
4 colors - simultaneous collection
FITC PE PETR
PE-CY5
侧向散射光(linear) 侧向散射光
前向散射光 (linear)
CD14 PE (log) CD45 FITC (log)
R1=单核细胞 (CD14+ve) R2=淋巴细胞 (CD45>单核细胞) R3=中性粒细胞 (CD45<单核细胞)
细胞分选
流式细胞仪的测量对象
大小 悬浮在溶液中的相互离散颗粒。 悬浮在溶液中的相互离散颗粒。 大小范围： 大小范围：0.2uM-300uM。 。 对象类型 细胞类型： 细胞类型： 高等真核细胞； （1） 高等真核细胞； 酵母； （2）酵母； 细菌； （3）细菌； 多细胞的聚集体，如胰岛等。 （4）多细胞的聚集体，如胰岛等。 非生命颗粒： 非生命颗粒： 和其它细胞器以及乳化微球等。 细胞核、染色体、和其它细胞器以及乳化微球等。
流式细胞术操作流程
样品 培养细胞 新鲜组织 石蜡包埋 标记 单细胞 悬液 检测 荧光抗体
表型测定
细胞分选
统计学 分析 继续 培养
PI＋Annexin－V 细胞凋亡检测 PI＋Annexin－
DNA DNA含量-PI
Annexin-V
PE＋FITC荧光标记检测外周血裂解后细胞群 PE＋FITC荧光标记检测外周血裂解后细胞群
全血细胞流式FSC-SSC图 图 全血细胞流式
数据处理
光信号
FSC SSC FL1 FL2 FL3
电信号
对数 线性 线性 线性 对数
脉冲处理， 脉冲处理，模数转换
（面积，峰高，宽度） 面积，峰高，宽度）
记录数据， 记录数据，显示结果
数据显示类型
X轴：代表荧光信号或 散射光信号的强度，用 “通道数”表示，可以 与光强度之间线性关系 或对数关系 Y轴：代表该通道内所 出现具有相同光信号特 征性细胞的频率
第 二 部 分 流式细胞术的应用
细 胞 周 期 分 析
样品制备
1000rpm 5分钟 1000rpm 5分钟 收集2X10 收集2X106个细胞
PBS漂
70%酒精 70%酒精 4度固定过夜
1000rpm 1000rpm 5min
收集固定的细胞 洗 两次 两次
离心 PBS
漂洗
37度消化1小时 37度消化1
荧光标记的选择
PE最强，适用于弱表达抗原 最强， 最强 FITC最便宜，适用于强表达抗原，适用范 最便宜， 最便宜 适用于强表达抗原， 围广 biotin-avidin不适合 弱抗原的检测 不适合
抗体使用原则
根据仪器型号和抗原表达强弱合理选择荧光抗 体 低表达抗原标记高S/N（信噪比）荧光素，如 PE、APC
荧光素种类
FITC(异硫氰酸荧光素）：绿色 530nm PE（藻红蛋白）：橙黄色 575nm PI(碘化丙啶）：橙红色 620nm
488nm波长的氩离子激光激发
PerCP(多甲藻黄素叶绿素蛋白）：深红色 675nm APC(别藻兰蛋白）：红色 660nm
630nm波长的氦氖激光或红色二极管激光激发
对比
流式细胞仪是一种特殊的显微镜
流式细胞仪
流动的细胞 数量大 高速分选 细胞群体特征量分布
显微镜
静止的细胞样本 数量少 样本难以再利用 可以揭示细胞内部结构信息
流式细胞仪 多参数 量化的分布 容易检测各个参数间的相关性
蛋白胶 单参数 平均值 不容易
功能特点 多参数定量分析每一个细胞； （1）多参数定量分析每一个细胞；
2.5µl 10µg/µl
0.5 PBS
RNase A 悬浮细胞
50µl 0.1mg/ml PI （含1%Triton)， （含1%Triton)，
混匀，室温 静止5 静止5分钟 上机
过300目细胞筛 300目细胞筛
细胞周期分析
细胞数
G1 S phase M
DNA 含量 G0/1
G1
G2
1 DNA含量
流式细胞仪产生的信号
非荧光信号
颗粒度
细胞大小
散射光信号区分裂解后的外周血细胞群
信号检测--散色光 信号检测 散色光
它反应细胞的物理特性,根据前侧向散射 光，可以把不同类型的细胞群加以区分 FSC（小角散射)光它反应细胞 的相对大小和截面积的大小 SSC (90度角散射光)代表细胞 的颗粒度和精细结构的变化
CD4+
淋巴细胞
R1
CD8+Ts淋巴细胞检测 淋巴细胞检测
CD8+
淋巴细胞
R1
B淋巴细胞检测 淋巴细胞检测
B淋巴细胞 淋巴细胞
淋巴细胞
R1
NK细胞检测
NK细胞 细胞
淋巴细胞
R1
染色体组型测定
2 4 5 3
1 白血病患者 1/3
Hoechst 33258 （AT）
6 X 13 8 Y 18 21 20 19 Ph 22
2
1
S
G2/M
细胞周期时相
细胞凋亡分析
Annexin V-PE/7-AAD双染色法 双染色法
双阴：活细胞
Annexin V-PE单阳：早期凋亡细胞 7-AAD单阳：坏死细胞
双阳：晚期凋亡细胞
人外周血淋巴细胞亚群检测
T淋巴细胞检测 淋巴细胞检测
T淋巴细胞 淋巴细胞
CD4+T（Th)淋巴细胞检测 淋巴细胞检测
（2）细胞分选； 细胞分选； 高纯度：99%以上 以上； 高纯度：99%以上； 可分析小于1/10000比例的稀有细胞群； 1/10000比例的稀有细胞群 可分析小于1/10000比例的稀有细胞群； 单细胞克隆等。 单细胞克隆等。 高通量（分析分选）． （3）高通量（分析分选）． 分析150,000 150,000个 分析150,000个/ 秒 分选100,000个/秒 分选100,000个 100,000
两色以上荧 光分析存在 光谱交叉
530 580 630 680 730 780 Emission wavelength (nm)
荧光信号
荧光染料被激发而发射的光信号。 荧光染料被激发而发射的光信号。 定量染色 荧光信号大小 被标记组分含量的定量
多荧光标记胞内多种组分， 多荧光标记胞内多种组分，实现多参数测量
流式细胞仪 （Flow Cytometer) 基础简介
2007年12月 2007年12月
王成昆
第 一 部 分 流式细胞术的一般介绍
什么是流式细胞仪
●
流式细胞仪实物
BD-Calibur
BD FACSVantage
流式细胞仪基本结构
●
FCM的定义 FCM的定义
流式细胞仪是指：使细胞（ 流式细胞仪是指：使细胞（或其 他粒子） 他粒子）以单个方式依次高速通过激 发光束， 发光束，采集细胞被光照时产生的各 种信号，对信号进行处理， 种信号，对信号进行处理，并对各参 数进行关联分析的一种仪器。 数进行关联分析的一种仪器。
流式细胞仪工作原理
液流与光源
流动 室
流体动力学聚焦
激光聚焦
探测光路聚焦
光信号收集
光信号分离，导向， 光信号分离，导向，各探测通道 PMT接收并转化为电信号 接收并转化为电信号。 PMT接收并转化为电信号。 激光束
侧向散射 光，荧光
1
二色镜 2
3
细胞 前向 散射 光
收集透镜
带通滤波片 光电倍增管
7 recip 9-22 9-12
Chromomycin A3
（GC）
结束语
流式细胞术是一种应用范围极广、灵活性很 强、技术含量较高、具有众多开发潜能、富有挑 战性的技术，需要掌握很多交叉学科知识，在科 研领域灵活运用这项技术，报告最科学、最真实 的客观数据，是我们的目标。
单参数直方图（Histogram）
二维等高图和密度图
Pseudo 3D Plot
3D Plot
便于数据统计 不同的细胞群 可以用不同的颜 色标记 主要表达方式
二维点图Dot Plot
光谱交叉
4 colors - simultaneous collection
FITC PE PETR
PE-CY5
侧向散射光(linear) 侧向散射光
前向散射光 (linear)
CD14 PE (log) CD45 FITC (log)
R1=单核细胞 (CD14+ve) R2=淋巴细胞 (CD45>单核细胞) R3=中性粒细胞 (CD45<单核细胞)
细胞分选
流式细胞仪的测量对象
大小 悬浮在溶液中的相互离散颗粒。 悬浮在溶液中的相互离散颗粒。 大小范围： 大小范围：0.2uM-300uM。 。 对象类型 细胞类型： 细胞类型： 高等真核细胞； （1） 高等真核细胞； 酵母； （2）酵母； 细菌； （3）细菌； 多细胞的聚集体，如胰岛等。 （4）多细胞的聚集体，如胰岛等。 非生命颗粒： 非生命颗粒： 和其它细胞器以及乳化微球等。 细胞核、染色体、和其它细胞器以及乳化微球等。
流式细胞术操作流程
样品 培养细胞 新鲜组织 石蜡包埋 标记 单细胞 悬液 检测 荧光抗体
表型测定
细胞分选
统计学 分析 继续 培养
PI＋Annexin－V 细胞凋亡检测 PI＋Annexin－
DNA DNA含量-PI
Annexin-V
PE＋FITC荧光标记检测外周血裂解后细胞群 PE＋FITC荧光标记检测外周血裂解后细胞群
全血细胞流式FSC-SSC图 图 全血细胞流式
数据处理
光信号
FSC SSC FL1 FL2 FL3
电信号
对数 线性 线性 线性 对数
脉冲处理， 脉冲处理，模数转换
（面积，峰高，宽度） 面积，峰高，宽度）
记录数据， 记录数据，显示结果
数据显示类型
X轴：代表荧光信号或 散射光信号的强度，用 “通道数”表示，可以 与光强度之间线性关系 或对数关系 Y轴：代表该通道内所 出现具有相同光信号特 征性细胞的频率
第 二 部 分 流式细胞术的应用
细 胞 周 期 分 析
样品制备
1000rpm 5分钟 1000rpm 5分钟 收集2X10 收集2X106个细胞
PBS漂
70%酒精 70%酒精 4度固定过夜
1000rpm 1000rpm 5min
收集固定的细胞 洗 两次 两次
离心 PBS
漂洗
37度消化1小时 37度消化1
荧光标记的选择
PE最强，适用于弱表达抗原 最强， 最强 FITC最便宜，适用于强表达抗原，适用范 最便宜， 最便宜 适用于强表达抗原， 围广 biotin-avidin不适合 弱抗原的检测 不适合
抗体使用原则
根据仪器型号和抗原表达强弱合理选择荧光抗 体 低表达抗原标记高S/N（信噪比）荧光素，如 PE、APC
荧光素种类
FITC(异硫氰酸荧光素）：绿色 530nm PE（藻红蛋白）：橙黄色 575nm PI(碘化丙啶）：橙红色 620nm
488nm波长的氩离子激光激发
PerCP(多甲藻黄素叶绿素蛋白）：深红色 675nm APC(别藻兰蛋白）：红色 660nm
630nm波长的氦氖激光或红色二极管激光激发
对比
流式细胞仪是一种特殊的显微镜
流式细胞仪
流动的细胞 数量大 高速分选 细胞群体特征量分布
显微镜
静止的细胞样本 数量少 样本难以再利用 可以揭示细胞内部结构信息
流式细胞仪 多参数 量化的分布 容易检测各个参数间的相关性
蛋白胶 单参数 平均值 不容易
功能特点 多参数定量分析每一个细胞； （1）多参数定量分析每一个细胞；
2.5µl 10µg/µl
0.5 PBS
RNase A 悬浮细胞
50µl 0.1mg/ml PI （含1%Triton)， （含1%Triton)，
混匀，室温 静止5 静止5分钟 上机
过300目细胞筛 300目细胞筛
细胞周期分析
细胞数
G1 S phase M
DNA 含量 G0/1
G1
G2
1 DNA含量
流式细胞仪产生的信号
非荧光信号
颗粒度
细胞大小
散射光信号区分裂解后的外周血细胞群
信号检测--散色光 信号检测 散色光
它反应细胞的物理特性,根据前侧向散射 光，可以把不同类型的细胞群加以区分 FSC（小角散射)光它反应细胞 的相对大小和截面积的大小 SSC (90度角散射光)代表细胞 的颗粒度和精细结构的变化
CD4+
淋巴细胞
R1
CD8+Ts淋巴细胞检测 淋巴细胞检测
CD8+
淋巴细胞
R1
B淋巴细胞检测 淋巴细胞检测
B淋巴细胞 淋巴细胞
淋巴细胞
R1
NK细胞检测
NK细胞 细胞
淋巴细胞
R1
染色体组型测定
2 4 5 3
1 白血病患者 1/3
Hoechst 33258 （AT）
6 X 13 8 Y 18 21 20 19 Ph 22
2
1
S
G2/M
细胞周期时相
细胞凋亡分析
Annexin V-PE/7-AAD双染色法 双染色法
双阴：活细胞
Annexin V-PE单阳：早期凋亡细胞 7-AAD单阳：坏死细胞
双阳：晚期凋亡细胞
人外周血淋巴细胞亚群检测
T淋巴细胞检测 淋巴细胞检测
T淋巴细胞 淋巴细胞
CD4+T（Th)淋巴细胞检测 淋巴细胞检测
（2）细胞分选； 细胞分选； 高纯度：99%以上 以上； 高纯度：99%以上； 可分析小于1/10000比例的稀有细胞群； 1/10000比例的稀有细胞群 可分析小于1/10000比例的稀有细胞群； 单细胞克隆等。 单细胞克隆等。 高通量（分析分选）． （3）高通量（分析分选）． 分析150,000 150,000个 分析150,000个/ 秒 分选100,000个/秒 分选100,000个 100,000
两色以上荧 光分析存在 光谱交叉
530 580 630 680 730 780 Emission wavelength (nm)
荧光信号
荧光染料被激发而发射的光信号。 荧光染料被激发而发射的光信号。 定量染色 荧光信号大小 被标记组分含量的定量
多荧光标记胞内多种组分， 多荧光标记胞内多种组分，实现多参数测量
流式细胞仪 （Flow Cytometer) 基础简介
2007年12月 2007年12月
王成昆
第 一 部 分 流式细胞术的一般介绍
什么是流式细胞仪
●
流式细胞仪实物
BD-Calibur
BD FACSVantage
流式细胞仪基本结构
●
FCM的定义 FCM的定义
流式细胞仪是指：使细胞（ 流式细胞仪是指：使细胞（或其 他粒子） 他粒子）以单个方式依次高速通过激 发光束， 发光束，采集细胞被光照时产生的各 种信号，对信号进行处理， 种信号，对信号进行处理，并对各参 数进行关联分析的一种仪器。 数进行关联分析的一种仪器。
流式细胞仪工作原理
液流与光源
流动 室
流体动力学聚焦
激光聚焦
探测光路聚焦
光信号收集
光信号分离，导向， 光信号分离，导向，各探测通道 PMT接收并转化为电信号 接收并转化为电信号。 PMT接收并转化为电信号。 激光束
侧向散射 光，荧光
1
二色镜 2
3
细胞 前向 散射 光
收集透镜
带通滤波片 光电倍增管