分子生物学实验技术斑马鱼胚胎显微注射实验步骤

斑马鱼胚胎显微注射实验步骤：

显微注射是指在显微镜下操作的微量注射技术。可将细胞的某一部分(如细胞核、细胞质或细胞器)或外源物质(如外源基因、DNA片段、信使核糖核酸、蛋白质等)通过玻璃毛细管拉成的细针，注射到细胞质或细胞核内。是研究各种生物分子的作用、制作转基因动物、克隆动物等的重要技术。显微注射应用的范围非常广泛，从辅助（体外）细胞受精技术至分子和细胞基本组分的转运都需使用这一技术，比较典型的是将某些物质注射进细胞中以操作和/或监测某种特定的存活细胞中的基本机体生物化学状态。这些可以注射进细胞的物质包括有：各种细胞器、激酶、组织化学标志物（比如辣根过氧化物酶或者荧光黄）、蛋白质、代谢物质、微磁头、离子、抗体、基因、分子生物学的mRNA和DNA等等。运用这一技术，也可以实现用于单个细胞或一组细胞的较少量（皮升至毫升）药剂或药物的精确输送（微灌注），例如药理学的药物检验。斑马鱼个体小，养殖成本低，能大规模繁殖，胚胎透明，体外发育，肉眼可见，因此斑马鱼胚胎是很好的开展显微注射的材料。

1、主要试剂的配制

（1）胚胎培养液的配制

称取0.8g NaCl、0.04g KCl、0.00358g Na2HPO4、0.006g KH2PO4、0.144g CaCl2、0.246g MgSO4•7H2O、0.35g NaHCO3、0.06g 青霉素、0.1g 链霉素加入含有800mL 灭菌水的1L烧杯中，搅拌至完全溶解，再用灭菌水定容至1L。（2）显微注射指示剂的配制

称取0.1克酚红溶于5ml灭菌的蒸馏水中，配制成2％的母液。先用1mm滤膜过滤后，再用0.22mm的滤膜再次过滤，然后储存在-20℃冰箱里备用。

2、显微注射操作

（1）注射针头的拉制：装上一根直径为1mm的毛细管，拧紧左右两侧的夹子，做好固定，并使其中间部位对准加热丝。设定参数为：Heat-600, Pull-55, Velocity-80, Time-10。然后按开始键，等待毛细管被拉成两个所需的微注射针头。

（2）琼脂糖注射槽的制作：称取0.4g琼脂糖，溶于30ml胚胎培养液中，在微波炉中加热溶解后，先倒入约10ml琼脂糖溶液到6cm的玻璃培养皿中，然后将注射槽模型轻轻放置于胶面上，再倒入约20ml。琼脂糖凝固后，取出注射

槽模型，便形成一个注射槽。每次使用前和使用后都用灭菌水清洗，之后加入少量灭菌水，4℃保存，可反复使用。

（3）显微注射用的胚胎收集：注射前天晚上挑选健康性成熟的斑马鱼按雌雄1：1 的比例放入交配缸中，中间用隔板隔开。饲养水温为28℃，pH值为 6.5～7.5，光周期为14L：10D。注射当天开灯后，实验准备就绪后将交配缸中的隔板拉开。一般情况下，雌鱼在雄鱼追逐10一20分钟后开始产卵。保证每次收集到的胚胎为一细胞期，用胚胎培养液漂洗数次后即可排布于琼脂糖注射槽中用于显微注射。每次用于显微注射的胚胎数以100枚为基准。

（4）注射体积的确定：打开显微注射仪的电源，打开氮气罐的阀门，调整进气量为60 psi，用微量进样针吸取1μl事先混入0.050%酚红的同源或异源核酸分子加到注射针底部。在物镜测微尺上滴一滴矿物油，用显微剪刀呈45度角剪掉尖端，直径约0.05mm，固定注射气压为30psi ，在此压力下调节注射时间为20～80msec （以10msec为间隔）的注射剂量（一般注射针头越大越能提高注射速度，注射过程中发生堵针的概率越低，但是由于机械损伤胚胎的死亡率也越高；而注射针头小时虽然死亡率低，但是容易堵针不利于大批量注射，经过长期尝试发现30msec为最佳注射时间），用物镜测微尺测量液滴直径(d)为0.1-0.2mm，根据球体积V = πd3/6，计算每次注射的体积为500pl-1000 pl。

（5）显微注射：用巴斯德吸管将刚刚受精的胚胎紧密排布在琼脂糖注射槽上，防止注射过程中胚胎滑动，一般排三排约为100枚胚胎。打开体视显微镜电源，选择放大倍数为2×10，把焦距对准第一排第一个胚胎，先用肉眼将注射针头移到该胚胎上空约5cm处，在目镜下降下针头，把针头调入到视野的中心，轻轻放下针头，直到看清楚为止。小心落下针尖，使其进入细胞质内。轻快的踩一下显微注射仪的踏板，马上轻轻上提针头，直到离开胚胎，然后用左手移到培养皿找到下一个胚胎进行注射。注射后注射的部位会出现淡淡的红色，约10秒钟才会渐渐地散去，如果是红色马上散去，说明注射液注入在绒毛膜中，必须重新再注射。

（6）培养观察：注射后的胚胎，用巴斯德吸管吸取几滴胚胎培养液滴加到注射槽内，刚好淹没所有胚胎，在室温下放置15-20分钟，让注射液在胚胎内部被充分吸收，然后用巴斯德吸管吸取一管胚胎培养液顺着注射槽将胚胎冲到一个

干净的培养皿中，挑除死亡胚胎，置于28℃培养箱中培养。分别在6h、12h、24h 这三个时间点挑除死亡胚胎，并及时换上新鲜的培养液。注射后24h在倒置荧光显微镜下观察荧光，拍照。