枯草芽孢杆菌发酵培养基的优化

在 500ml 三角瓶中装 50ml 培养基 ,灭菌 。调其初始 pH 值到 712 ,以 2 %的接菌量接菌 (即 在每 100ml 的液体培养基 中接入 2ml 浓度 为 1 ×108/ ml 的芽 孢悬浮 液) ; 接菌 后于 温度为 30 ℃,转速为 200r/ min 的摇床内进行发酵培养 ; 每 2h 取样 ,显微镜检查 ,芽孢形成率达 80 % 时 ,测其含菌量 。 115 含菌量测定
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增刊 张丽霞等 : 枯草芽孢杆菌发酵培养基的优化
件 ,提高发酵液含菌量 。本研究针对应用于生产上的一种发酵培养基作为初始发酵培养基 ,采 用 Plackett2Bruman 设计与响应面分析方法( RSA) 相结合的试验统计方法进行优化 ,确定了该培 养基中影响 B908 发酵液含菌量的主要因子及其最佳配比 : 玉米粉 (1310g/ L) 、CaCO3 (710 g/ L) 和豆饼粉 (2015 g/ L) ,使 B908 菌株的发酵液含菌量提高 。
枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis) B908 是中国农业大学植物病害生物防治研究室从水稻根 际土壤中分离获得的有益菌株 ,对水稻纹枯病 、棉花枯萎病 、小麦赤霉病等多种植物病害有明 显的防治效果[1 ] ,应用前景广阔 。该芽孢杆菌已经制成制剂而应用于农业生产 。制剂中的芽 孢含量是影响制剂应用效果的关键因素 。本研究通过优化发酵培养基配方 ,提高发酵液中芽 孢含量 ,降低生产成本 ,提高制剂的生防效果 。
关 键 词 : 枯草芽孢杆菌 ; 发酵培养基 ; Plackett2Burman; 响应面分析法 中图分类号 : S476111 文献标识码 : A 文章编号 : 100529261 (2006) 增刊20082207
Optim ization of Bacillus s ubtilis B908 Fer mentation Medium
ZHANG Li2xia , LI Rong2xi , WANG Qi , MEI Ru2hong
(Department of Agronomy , Inner Mongolia Agricultural University , Inner Mongolia 010018 , China)
Abstract : Plackett2Burman design and response surface analysi s were used to optimize the fermentation medium of Bacillus subtilis B9081 Based on t he results of Plackett2Burman design , impo rtant factors af2 fecting the yield of Bacillus subtilis B908 were corn flour , bean flour and CaCO31 Then , the three factors were further optimized using response surface analysis. The optimized fermentation medium allowed the pro duction to be i ncreased from 616 ×109spores ml - 1 to 1118 ×1010spores ml - 11 Key wor ds : Bacillus subtilis ; fermentatio n medium ; Plackett2Burman ; response surface analysis
摘要 : 在摇瓶发酵条件下 ,采用 Plackett2Burman 设计法和响应面分析法对枯草芽孢杆菌 B908 菌株的培养基配方进行优化 ,确定了影响 B908 菌株发酵液含菌量的 3 个重要因子依次为玉米 粉 、碳酸钙和豆饼粉 ; 对这 3 个因子进行爬坡路径试验 ,通过响应面分析法确定了主要影响因 子的最佳条件 。优化后的培养基配方使摇瓶发酵液每毫升的含菌量从 016 ×109 个/ ml 提高到 1118 ×1010个/ ml 。
因子的可信度大于 85 % ,对发酵液含菌量影响显著 ,是影响发酵液含菌量的主要影响因子 (表 1、表 2) 。这 3 种组分对发酵液含菌量均是正影响 (t 为正值) 。
表 1 Plackett2Bur man 试验设计与结果
试验 次数
X1 X2 X3 X4 X5 X6 X7 X8 X9 X10 X11 X12 X13 X14 X15 X16
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1 材料与方法
111 供试菌株 枯草芽孢杆菌 B908 ,从水稻根际土壤中分离获得 ,由中国农业大学植物病理学系植物病
害生物防治研究室提供。 112 培养基
液体种子培养基 : 肉汁胨培养基[3] 。初始发 酵培养基 : 玉 米粉 10g ,葡萄 糖 5g ,豆饼粉 15g ,鱼粉 5g , CaCO3 5g , ( NH4 ) 2SO4 1g , K2HPO4 013g , MgSO4 ·7 H2O 012g , MnSO4 ·H2O 012g , 水 1000ml 。 113 培养基配方的优化方案设计 11311 Plackett2Burman 设计法[4 ]筛选培养基中影响发酵液含菌量的重要因子 将初始发酵培 养基中的 9 个组分作为影响因素进行全面考察 ,选择 16 因子三水平的试验设计 ,以 X1、X4 、X7 、 X10 、X13 、X15 、X16为空项以估计试验误差 ,以 X2 、X3 、X5 、X6 、X8 、X9 、X11 、X12 、X14分别代表玉米粉、 葡萄糖 、豆饼粉 、鱼粉 、CaCO3 、(NH4) 2SO4 、K2HPO4、MgSO4·7 H2O、MnSO4·H2O ,每个因素取高低两 个水平 (表 1) 。 11312 最陡爬坡路径方法[5]确定重要因子的最适浓度范围 影响发酵液含菌量的重要影响 因子确定后 ,对这些因子进行最陡爬坡路径试验 ,以初始发酵培养基的浓度为基础 ,以适当的 梯度改变重要影响因子在发酵培养基中的浓度 ,其他组分取低水平即初始发酵培养基的浓度 , 考察发酵液含菌量变化趋势 ,确定最适浓度范围 。 11313 响应面分析法[6 ]确定最佳发酵培养基配方 响应面分析法是一种寻找多因素系统中 最佳条件的数 学统计方法 。其中 ,Box2behnken 和 Box2Wilson 中 心组合设计 是两种较常 用的 RSA 法。Box2behnken 法适用于 2～5 个因素的优化试验 ,每个因素取 3 个水平 ,以 - 1 ,0 ,1 编 码 。根据相应的试验表进行试验后 ,对数据进行二次回归拟合 ,得到带交互项和平方项的二次 方程 ,最后在一定的水平范围内求出最佳值 ,最后进行模型验证[7 ] 。 114 发酵条件
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目前 ,生产上枯草芽孢杆菌的发酵培养基配方的主要成分有玉米粉 、葡萄糖 、豆饼粉 、鱼粉 以及其它一些微量元素。但由于配比的不合适使得发酵液含菌量不高 。发酵培养基的成分对 微生物发酵液含菌量有很大的影响[2] 。调整培养基中各物质的配比 ,可以改善细菌的生长条
收稿日期 : 2006204225 基金项目 : 国家 863 科技攻关项目 作者简介 : 张丽霞 (1979 - ) ,女 ,硕士 ; 3 通讯作者 ,博导 , 电话 : 010262731460 , E2mail : wangqi @cau. edu. c n。
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22 (增刊) 82 - 88 中国生物防治 Chinese Journal of Biological Control 2006 年 10 月
枯草芽孢杆菌发酵培养基的优化
张丽霞1 ,2 , 李荣禧1 , 王 琦2 3 , 梅汝鸿2
(11内蒙古农业大学农学院 , 呼和浩特 010018 ; 21 中国农业大学植物病理学系 , 北京 100094)
20 - 1 - 1 - 1 - 1 - 1 - 1 - 1 - 1 - 1 - 1 - 1 - 1 - 1 - 1 - 1 - 1
菌量 (109 个/ ml )
8152 9141 8112 8134 8138 9123 7139 9125 12100 8188 9195 9153 11137 9155 8108 7147 7138 8100 8175 6130
计数器计数法[3 ] 。3 次重复 。
2 结果与分析
211 初始发酵培养基中主要影响因子的确定 对初始发酵培养基组分中的 9 个因素进行了考察 ,玉米粉 、豆饼粉和 CaCO3 作为重要影响
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中 国 生 物 防 治 第 22 卷
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18175
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t
51677844 01964109 41499641 01053174 51760875 11476142 01057848 11796096 01292181
Pr > | t |
01097369 01398558 01124037 01832461 01095859 01311280 01825430 01272647 01626378
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重要性排序
1 6 3 7 2 4 9 5 8
212 培养基重要影响因子的最适浓度范围的确定 对玉米粉、豆饼粉和 CaCO3 三个主要影响因子进行最陡爬坡路径试验 ,确定此三因子的最
因子符号
X2 X3 X5 X6 X8 X9 X11 X12 X14
因子
玉米粉 葡萄糖 豆饼粉 鱼粉 CaCO3 (NH4) 2SO4 K2 HPO4 MgSO4·7H2O MnSO4·H2O
表 2 Plackett2Bur man 试验分析结果
水 平 (浓度 g/ L)
1
-1
12150
1010
6125