实时荧光定量PCR技术 (1)
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关键点： 设计合适引物，防止非特异性扩增！
SYBR Green I 染料法——融解曲线
原始图谱 对数图谱
将温度与荧光强度的变化求导 (-dI/dT)
SYBR Green I染料法——融解曲线
融解曲线分析，单一峰 无非特异性荧光 定量准确
融解曲线分析，出现杂峰 其他产物出现非特异性荧 光，因此定量不准确
Ck 104
Ck 102
Cycle number
Lg of DNA concentration
qPCR 常用实验方法
A B C
简单 成本较低
适用于多重PCR 特异性较好
可进行SNP检测 特异性非常好
SYBR Green I 染料法——原理
SYBR Green I 是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色 激发波长的染料
优 点
高度特异性 重复性好 灵敏度高 可进行多重定量
缺 点
只适合一个特定的目标 委托公司标记，价格较高 不易找到本底低的探针
实时荧光定量PCR的分类－－分子信标
环
标记荧光的发夹探针
茎
环与目标序列互补
茎由互补配对序列组成
荧光素 淬灭剂
实时荧光定量PCR的分类——分子信标
PMT2-VIC detection- GAPDH
肿瘤 正常
肿瘤 正常
双标准曲线法——实验结果
ERBB2表达
Multiplex Reactions: C(t) Healthy RNA 28.40 28.46 28.43± 0.04 Carcinoma 27.36 27.12 26.24 ± 0.17
2、反应参数的确定：
一般为：94 ℃，10-20S 60℃，30-60S（Taq酶5′→3′外切核酸酶活性在60℃ 最高），也可通过温度 梯度优化退火温度
3、优化引物和探针浓度：获得最小Ct值，最大信号/背景比值 引物浓度：100-900nM 探针浓度：50-300nM 4、其他与常规PCR相同
Taqman探针法——优缺点
实时荧光定量PCR技术
内容概要
荧光定量PCR的基本概念 荧光定量PCR的标记方法 荧光定量PCR解析方法
SYBR法实验流程及注意事项
常规PCR与实时荧光定量PCR
•
•
常规PCR：借助电泳对扩增反应的终产物进行半定量及定性分析
实时荧光定量PCR技术：利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个 循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的关系对起始模板进行定量分析
相关系数（R2）：大于0.98，越接近1，结果可信度越高。 扩增效率（E）：0.9-1.1, 越接近1，越理想。
乙肝病人血液中HBV的绝对定量
未知样品拷贝数的计算 将Ct值带入线性方程： 20.5= -3.29 X + 40.33 X= 20.5-40.33 -3.29
Unknown
=6.03
Quantity
荧光定量PCR常用的三个概念
扩增曲线
荧光阈值 CT值
扩增曲线
荧光基团
平台期 Rn（荧光强度）
Lg－liner phase
Baseline
荧光检测元件
Cycle（循环数）
荧光阈值
前15个循环信号作为荧光 本底信号（baseline） 荧光阈值的缺省设置是3～ 15个循环的荧光信号的标准偏 差的10倍 手动设置：大于荧光背景 值和阴性对照的荧光最高值； 进入指数期的最初阶段 真正的信号:荧光信号超过 阈值
Rn（荧光强度）Leabharlann Baidu平台期
Lg－liner phase Threshold
Baseline Cycle（循环数）
Ct值
Ct值的定义：
PCR扩增过程中，扩增产物 的荧光信号达到设定的阈值时 所经过的扩增循环次数
Rn（荧光强度）
Ct值的特点：
相同模板进行96次扩增，终点 处产物量不恒定；Ct值极具重 现性
•
•
将C(t)和达到C(t)值时终产物的量Xc(t)带入上式得：
log X0= (- log(1+Ex) ) ×C(t)+ log Xc(t)
初始浓度的对数与循环数呈线性关系
Ct值与模板起始量的关系
Sample
模板DNA量越多，荧光达到 阈值的循环数越少，即Ct值越小。 Log模板起始浓度与Ct值呈线 性关系。
Ct value
Cycle（循环数）
Ct值的数学原理
• 理想的PCR反应：
Xn=X0×2n
•
•
非理想的PCR反应：
Xn=X0 (1+Ex)n
方程式两边同时取对数得:
log Xn=log [X0 (1+Ex)n]
整理方程式得: log X0= (- log (1+Ex) )×n+ log Xn
n：扩增反应的循环次数 Xn：第n次循环后的产物量 X0：初始模板量 Ex：扩增效率
FRET
实时荧光定量PCR的分类——分子信标
优点
高特异性：对目标序列 检测SNP最灵敏的试剂之一 荧光背景低
缺点
只能用于一个特定目标
设计困难
价格比较高
几种方法的应用比较
方法 SYBR Green I 优点 适用性广 灵敏 方便 便宜 特异性高 缺点 引物要求高 易出现非特异性带 适用范围 适合科研中对各种目的基 因定量分析，基因表达量 的研究，转基因重组动植 物的研究 病原体检测，疾病耐药基 因研究,药物疗效考核 遗传疾病的诊断 特定基因分析 SNP分析
STD 0.16 0.04 0.12 0.10 0.05
未知样品 空白对照
乙肝病人血液中HBV的绝对定量
标准曲线制作：利用Mean Ct 作图可得到标准曲线 y = -3.29x + 40.33 R2 = 0.9978
扩增效率（E）计算 E = 10-1/slope －1 = 10-1/-3.29 －1 = 2.01－1 = 1.01
2 1.8 1.6 1.4 1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 Healthy Tissue Carc. Tissue
标准品
标准品 标准品 标准品
copies/ml 5×103 5×104 5×105 5×106 ?
Ct1 28.18 25.25 22.11 18.63 20.56 None
Ct2 28.64 25.14 22.46 18.92 20.45 None
Mean Ct 28.41 25.19 22.28 18.77 20.5
实验组
相对定量分析方法
双标准曲线法
2 -△△Ct法
相对定量分析实例分析
• • • 利用TaqMan法研究ERBB2 在正常或乳腺肿瘤组织标本中的表达差异 已知在50%的乳腺肿瘤样本中, ERBB2表达异常, 因此可以作为一个检测标准 选用GAPDH作为内标基因
– FAM标记的ERBB2探针 – VIC标记的GAPDH探针
PCR产物、基因组DNA等。
重复反应孔 –——建议每个样本使用三个或更多重复反应，以确保统计 显著性。
标记方法的选择——SYBR Green法或探针法均可。
实验结果显示——扩增曲线；标准曲线；融解曲线（探针法不需要）。
质粒标准品稀释方法与拷贝数计算
倍比梯度稀释方法：
1v原液(标准品i) +9v稀释缓冲液，得标准品ii 1v标准品ii+9v稀释缓冲液，得标准品iii 1v标准品iii+9v稀释缓冲液，得标准品iv 1v标准品iv +9v稀释缓冲液，得标准品v
SYBR Green I
SYBR Green I 染料法——作用机理
热变性
引物退火
延伸反应
SYBR Green I染料法——问题点与关键点
问题点：
SYBR Green I与双链DNA进行结合后散发荧光，因此如 果反应体系中有非特异性扩增或引物二聚体的产生，也将
同时被检测，从而可能导致检测结果不准确。
相对定量分析——管家基因筛选
管家基因
维持细胞基本代谢活动所必须的基因, 如：GAPDH、Actin、18S rRNA等
筛选方法
根据文献提供 通过具体实验筛选
实验值
6 5 4 3 2 1 0
Sample1
Sample2
Sample3
Sample4
P P O P
β-Actin GAPDH
β-2-microglobulin HPRT
标准品：质粒标准品浓度为106、105 、104 、 103 ；2个重复；设阴性空白对照 实验步骤：提取HBV DNA； 设计特异引物；
设计TaqMan探针并标记探针；
荧光定量扩增； 结果分析：获取血液样品中HBV DNA的精确copy数。
乙肝病人血液中HBV的绝对定量
实验数据
Sample
绝对定量
Log（起始浓度）与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品
可作出标准曲线,即得到该扩增反应存在的线性关系
根据样品Ct值，就可以计算出样品中所含的模板量
Sample
2 5
绝对定量分析几要素
一个目的基因 ——即需要确定其量值的核酸序列。 一组标准样本 ——用来生成标准曲线。可以是含有目的基因的质粒、
Taqman探针法——工作机理
探针
报告基团 淬灭基团
热变性
引物
引物和探针与模板退火
DNA聚合酶
探针
延伸反应
Taqman探针法——PCR体系的建立
1、引物、探针的设计：
探针Tm为68-70℃ ，<30 bp, 5’不能有G，G可能会淬灭荧光素， 引物尽量靠近探针，扩增片段<400 bp，引物Tm为59-60℃
=10 6.03 =1,071,519 copies
相对定量的必要性
理论上目的基因表达量分析条件 实际目的基因表达量分析
Sample A
Sample B
细胞起始数相同
RNA提取效率相同
目的基因扩增效率相同
相对定量分析几要素
一个参照样本 一个或一个以上的未知样本
一个目的基因
管家基因——用来校对不同样本之间目的基因的实际表达量 重复反应孔 –——建议每个样本设置三个或三个以上重复孔，以确保统计结果的 可信度。 标记方法的选择——SYBR Green法或探针法均可。 实验结果显示——扩增曲线；标准曲线；融解曲线（探针法不需要）。 一组标准样本（有些分析方法不需要）
SYBR Green I 染料法——优缺点
优 点
使用方便，不必设计复杂 探针 具有价格优势
缺 点
无模板特异性 对引物特异性要求较高 不能进行多重定量 灵敏度相对较低
Taqman探针法——原理
5′端标记有报告基团(Reporter, R) ，如FAM、VIC等
3′端标记有荧光淬灭基团 (Quencher, Q) 探针完整，R发射的荧光能量被Q基团吸收 ，无荧光， R与Q分开，发荧光 Taq酶有 5′→3′外切核酸酶活性，可水解探针
拷贝数的计算：
待测样本浓度（ng/ul）＝OD260×40×稀释倍数
样本分子量=碱基数×324 待测样本拷贝数（copies/ul）=待测样本浓度/样本分子量×6×1014
绝对定量实验例——乙肝病人血液中HBV的绝对定量
方
试
法：从血液中提取病毒DNA，以TaqMan探针法进行荧光定量检测 剂：RealMasterMix（Probe）
GAPDH表达
Multiplex Reactions: C(t)
Healthy RNA
23.27 23.41 28.34± 0.10
Carcinoma
22.81 22.86 26.83 ± 0.03
双标准曲线法——结果分析
Copies ng/ µl Total RNA
Healthy RNA 1095 1052 95500 85730 Tumor RNA 2130 2492 136000 130800
•
构建标准曲线
•
•
双重PCR反应
阴性对照
– 无RNA对照（空白） – 无逆转录酶对照（基因组）
双标准曲线法
Color 1 – FAM detection for ERBB2
Color 2 - VIC detection for GAPDH
样品扩增：正常vs肿瘤
PMT1-FAM detection- ERBB2
价格高
TaqMan
Molecular Beacon
重复性好
高特异性 荧光 背景低
只适合特定目标
只适合特定目标 设计困难 价格高
绝对定量vs 相对定量
• 绝对定量
– 标准曲线由已知浓度的RNA、质粒生成
– 定量未知模板
– 标准样品和未知样品必须同时反应
• 相对定量
– Ct Method: 使用内参基因定量所研究样品和参照样品目的基因， 参照基因可以与目的基因同时反应，也可以单独反应。 – 双标准曲线法：对每个样品的内参基因和目的基因都做绝对定量，求出每个样品 中内参基因和目的基因的绝对数量，然后根据相对定量的基本公式来求出目的基 因的差异表达。
SYBR Green I 染料法——融解曲线
原始图谱 对数图谱
将温度与荧光强度的变化求导 (-dI/dT)
SYBR Green I染料法——融解曲线
融解曲线分析，单一峰 无非特异性荧光 定量准确
融解曲线分析，出现杂峰 其他产物出现非特异性荧 光，因此定量不准确
Ck 104
Ck 102
Cycle number
Lg of DNA concentration
qPCR 常用实验方法
A B C
简单 成本较低
适用于多重PCR 特异性较好
可进行SNP检测 特异性非常好
SYBR Green I 染料法——原理
SYBR Green I 是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色 激发波长的染料
优 点
高度特异性 重复性好 灵敏度高 可进行多重定量
缺 点
只适合一个特定的目标 委托公司标记，价格较高 不易找到本底低的探针
实时荧光定量PCR的分类－－分子信标
环
标记荧光的发夹探针
茎
环与目标序列互补
茎由互补配对序列组成
荧光素 淬灭剂
实时荧光定量PCR的分类——分子信标
PMT2-VIC detection- GAPDH
肿瘤 正常
肿瘤 正常
双标准曲线法——实验结果
ERBB2表达
Multiplex Reactions: C(t) Healthy RNA 28.40 28.46 28.43± 0.04 Carcinoma 27.36 27.12 26.24 ± 0.17
2、反应参数的确定：
一般为：94 ℃，10-20S 60℃，30-60S（Taq酶5′→3′外切核酸酶活性在60℃ 最高），也可通过温度 梯度优化退火温度
3、优化引物和探针浓度：获得最小Ct值，最大信号/背景比值 引物浓度：100-900nM 探针浓度：50-300nM 4、其他与常规PCR相同
Taqman探针法——优缺点
实时荧光定量PCR技术
内容概要
荧光定量PCR的基本概念 荧光定量PCR的标记方法 荧光定量PCR解析方法
SYBR法实验流程及注意事项
常规PCR与实时荧光定量PCR
•
•
常规PCR：借助电泳对扩增反应的终产物进行半定量及定性分析
实时荧光定量PCR技术：利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个 循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的关系对起始模板进行定量分析
相关系数（R2）：大于0.98，越接近1，结果可信度越高。 扩增效率（E）：0.9-1.1, 越接近1，越理想。
乙肝病人血液中HBV的绝对定量
未知样品拷贝数的计算 将Ct值带入线性方程： 20.5= -3.29 X + 40.33 X= 20.5-40.33 -3.29
Unknown
=6.03
Quantity
荧光定量PCR常用的三个概念
扩增曲线
荧光阈值 CT值
扩增曲线
荧光基团
平台期 Rn（荧光强度）
Lg－liner phase
Baseline
荧光检测元件
Cycle（循环数）
荧光阈值
前15个循环信号作为荧光 本底信号（baseline） 荧光阈值的缺省设置是3～ 15个循环的荧光信号的标准偏 差的10倍 手动设置：大于荧光背景 值和阴性对照的荧光最高值； 进入指数期的最初阶段 真正的信号:荧光信号超过 阈值
Rn（荧光强度）Leabharlann Baidu平台期
Lg－liner phase Threshold
Baseline Cycle（循环数）
Ct值
Ct值的定义：
PCR扩增过程中，扩增产物 的荧光信号达到设定的阈值时 所经过的扩增循环次数
Rn（荧光强度）
Ct值的特点：
相同模板进行96次扩增，终点 处产物量不恒定；Ct值极具重 现性
•
•
将C(t)和达到C(t)值时终产物的量Xc(t)带入上式得：
log X0= (- log(1+Ex) ) ×C(t)+ log Xc(t)
初始浓度的对数与循环数呈线性关系
Ct值与模板起始量的关系
Sample
模板DNA量越多，荧光达到 阈值的循环数越少，即Ct值越小。 Log模板起始浓度与Ct值呈线 性关系。
Ct value
Cycle（循环数）
Ct值的数学原理
• 理想的PCR反应：
Xn=X0×2n
•
•
非理想的PCR反应：
Xn=X0 (1+Ex)n
方程式两边同时取对数得:
log Xn=log [X0 (1+Ex)n]
整理方程式得: log X0= (- log (1+Ex) )×n+ log Xn
n：扩增反应的循环次数 Xn：第n次循环后的产物量 X0：初始模板量 Ex：扩增效率
FRET
实时荧光定量PCR的分类——分子信标
优点
高特异性：对目标序列 检测SNP最灵敏的试剂之一 荧光背景低
缺点
只能用于一个特定目标
设计困难
价格比较高
几种方法的应用比较
方法 SYBR Green I 优点 适用性广 灵敏 方便 便宜 特异性高 缺点 引物要求高 易出现非特异性带 适用范围 适合科研中对各种目的基 因定量分析，基因表达量 的研究，转基因重组动植 物的研究 病原体检测，疾病耐药基 因研究,药物疗效考核 遗传疾病的诊断 特定基因分析 SNP分析
STD 0.16 0.04 0.12 0.10 0.05
未知样品 空白对照
乙肝病人血液中HBV的绝对定量
标准曲线制作：利用Mean Ct 作图可得到标准曲线 y = -3.29x + 40.33 R2 = 0.9978
扩增效率（E）计算 E = 10-1/slope －1 = 10-1/-3.29 －1 = 2.01－1 = 1.01
2 1.8 1.6 1.4 1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 Healthy Tissue Carc. Tissue
标准品
标准品 标准品 标准品
copies/ml 5×103 5×104 5×105 5×106 ?
Ct1 28.18 25.25 22.11 18.63 20.56 None
Ct2 28.64 25.14 22.46 18.92 20.45 None
Mean Ct 28.41 25.19 22.28 18.77 20.5
实验组
相对定量分析方法
双标准曲线法
2 -△△Ct法
相对定量分析实例分析
• • • 利用TaqMan法研究ERBB2 在正常或乳腺肿瘤组织标本中的表达差异 已知在50%的乳腺肿瘤样本中, ERBB2表达异常, 因此可以作为一个检测标准 选用GAPDH作为内标基因
– FAM标记的ERBB2探针 – VIC标记的GAPDH探针
PCR产物、基因组DNA等。
重复反应孔 –——建议每个样本使用三个或更多重复反应，以确保统计 显著性。
标记方法的选择——SYBR Green法或探针法均可。
实验结果显示——扩增曲线；标准曲线；融解曲线（探针法不需要）。
质粒标准品稀释方法与拷贝数计算
倍比梯度稀释方法：
1v原液(标准品i) +9v稀释缓冲液，得标准品ii 1v标准品ii+9v稀释缓冲液，得标准品iii 1v标准品iii+9v稀释缓冲液，得标准品iv 1v标准品iv +9v稀释缓冲液，得标准品v
SYBR Green I
SYBR Green I 染料法——作用机理
热变性
引物退火
延伸反应
SYBR Green I染料法——问题点与关键点
问题点：
SYBR Green I与双链DNA进行结合后散发荧光，因此如 果反应体系中有非特异性扩增或引物二聚体的产生，也将
同时被检测，从而可能导致检测结果不准确。
相对定量分析——管家基因筛选
管家基因
维持细胞基本代谢活动所必须的基因, 如：GAPDH、Actin、18S rRNA等
筛选方法
根据文献提供 通过具体实验筛选
实验值
6 5 4 3 2 1 0
Sample1
Sample2
Sample3
Sample4
P P O P
β-Actin GAPDH
β-2-microglobulin HPRT
标准品：质粒标准品浓度为106、105 、104 、 103 ；2个重复；设阴性空白对照 实验步骤：提取HBV DNA； 设计特异引物；
设计TaqMan探针并标记探针；
荧光定量扩增； 结果分析：获取血液样品中HBV DNA的精确copy数。
乙肝病人血液中HBV的绝对定量
实验数据
Sample
绝对定量
Log（起始浓度）与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品
可作出标准曲线,即得到该扩增反应存在的线性关系
根据样品Ct值，就可以计算出样品中所含的模板量
Sample
2 5
绝对定量分析几要素
一个目的基因 ——即需要确定其量值的核酸序列。 一组标准样本 ——用来生成标准曲线。可以是含有目的基因的质粒、
Taqman探针法——工作机理
探针
报告基团 淬灭基团
热变性
引物
引物和探针与模板退火
DNA聚合酶
探针
延伸反应
Taqman探针法——PCR体系的建立
1、引物、探针的设计：
探针Tm为68-70℃ ，<30 bp, 5’不能有G，G可能会淬灭荧光素， 引物尽量靠近探针，扩增片段<400 bp，引物Tm为59-60℃
=10 6.03 =1,071,519 copies
相对定量的必要性
理论上目的基因表达量分析条件 实际目的基因表达量分析
Sample A
Sample B
细胞起始数相同
RNA提取效率相同
目的基因扩增效率相同
相对定量分析几要素
一个参照样本 一个或一个以上的未知样本
一个目的基因
管家基因——用来校对不同样本之间目的基因的实际表达量 重复反应孔 –——建议每个样本设置三个或三个以上重复孔，以确保统计结果的 可信度。 标记方法的选择——SYBR Green法或探针法均可。 实验结果显示——扩增曲线；标准曲线；融解曲线（探针法不需要）。 一组标准样本（有些分析方法不需要）
SYBR Green I 染料法——优缺点
优 点
使用方便，不必设计复杂 探针 具有价格优势
缺 点
无模板特异性 对引物特异性要求较高 不能进行多重定量 灵敏度相对较低
Taqman探针法——原理
5′端标记有报告基团(Reporter, R) ，如FAM、VIC等
3′端标记有荧光淬灭基团 (Quencher, Q) 探针完整，R发射的荧光能量被Q基团吸收 ，无荧光， R与Q分开，发荧光 Taq酶有 5′→3′外切核酸酶活性，可水解探针
拷贝数的计算：
待测样本浓度（ng/ul）＝OD260×40×稀释倍数
样本分子量=碱基数×324 待测样本拷贝数（copies/ul）=待测样本浓度/样本分子量×6×1014
绝对定量实验例——乙肝病人血液中HBV的绝对定量
方
试
法：从血液中提取病毒DNA，以TaqMan探针法进行荧光定量检测 剂：RealMasterMix（Probe）
GAPDH表达
Multiplex Reactions: C(t)
Healthy RNA
23.27 23.41 28.34± 0.10
Carcinoma
22.81 22.86 26.83 ± 0.03
双标准曲线法——结果分析
Copies ng/ µl Total RNA
Healthy RNA 1095 1052 95500 85730 Tumor RNA 2130 2492 136000 130800
•
构建标准曲线
•
•
双重PCR反应
阴性对照
– 无RNA对照（空白） – 无逆转录酶对照（基因组）
双标准曲线法
Color 1 – FAM detection for ERBB2
Color 2 - VIC detection for GAPDH
样品扩增：正常vs肿瘤
PMT1-FAM detection- ERBB2
价格高
TaqMan
Molecular Beacon
重复性好
高特异性 荧光 背景低
只适合特定目标
只适合特定目标 设计困难 价格高
绝对定量vs 相对定量
• 绝对定量
– 标准曲线由已知浓度的RNA、质粒生成
– 定量未知模板
– 标准样品和未知样品必须同时反应
• 相对定量
– Ct Method: 使用内参基因定量所研究样品和参照样品目的基因， 参照基因可以与目的基因同时反应，也可以单独反应。 – 双标准曲线法：对每个样品的内参基因和目的基因都做绝对定量，求出每个样品 中内参基因和目的基因的绝对数量，然后根据相对定量的基本公式来求出目的基 因的差异表达。