不同产地灵芝孢子粉中多糖＼总三萜皂苷含量测定

不同产地灵芝孢子粉中多糖＼总三萜皂苷含量测定
目的建立灵芝孢子粉中灵芝多糖、总三萜皂苷的含量测定方法。

方法采用紫外分光光度法，苯酚-浓硫酸比色法于波长492nm处测定灵芝多糖吸光度；以香草醛∶高氯酸∶冰乙酸（2∶8∶50）为显色剂，于波长555nm处测定总三萜皂苷的吸光度。

结果多糖、总三萜皂苷的标准曲线的线性范围分别为0.0100~0.0300mg（r=0.9982）；0.025~0.125mg（r=0.9996），多糖、總三萜皂苷的平均加样回收率分别为101.17%、100.74%，RSD分别为1.84%、1.29%。

结论该方法简便、快速、准确，可用于灵芝孢子粉中多糖、总三萜皂苷的含量测定。

Abstract：Objective To establish a method for content determination of total polysaccharides and triterpenoid saponin in the GLS.Methods UV Spectrophotometry,phenol-sulfuric acid;vanillin-glacial acetic acid-sulphuric acid-perchloric acid mixture at the wavelength of 492nm and 555nm absorbance.Results The linear range of total ginseng polysaccharides was 0.0100~0.0300mg(r=0.9982);0.025~0.125mg(r=0.9996).The recovery rate of the study was 101.17%、100.74%,RSD=1.84%、1.29%.Conclusion The results of simulation indicate that this method was accurate,reliable and reproducible.It was suggested that this method can be used to determine the content of total polysaccharides and triterpenoid saponin in the GLS.
Key words：GLS;Polysaccharides;Triterpenoid saponin;Determination;Ultraviolet spectrophotometry灵芝，为担子菌纲多孔菌科灵芝属真菌赤芝（Ganoderma lucidum（Leyss.ex Fr.）Karst）、紫芝（Ganoderma sinense Zhao，Xu et Zhang）的干燥子实体。

灵芝孢子粉是灵芝在生长成熟期，从灵芝菌褶中弹射出来的极其微小的卵形生殖细胞，主产于安徽大别山、浙江、山东、吉林，具有扶正固本、健脾和胃、补益精气功能，能够调节和增强人体免疫力和预防心脑血管病的作用，同时还有抗疲劳、美容美颜、延缓衰老与及预防艾滋病的功效[1,2]。

灵芝孢子粉的主要有效成分为灵芝多糖和三萜类化合物，不同来源的样品，其灵芝多糖和灵芝三萜皂苷含量存在较大差异[3,4]，本研究考察产区的灵芝孢子粉的多糖及三萜皂苷含量，建立灵芝孢子粉中灵芝多糖、总三萜皂苷含量测定的方法，实验结果表明该方法准确、快速，为灵芝的深入研究及质量控制提供了更加可靠的方法。

1仪器与试药
1.1仪器紫外可见分光光度计（Bluestar A北京莱伯泰科仪器有限公司）；分析天平（Sartorius BP211D北京赛多利斯天平有限公司）；循环水式多用真空泵（SH-B巩义市仪器有限责任公司）。

1.2试药无水葡萄糖对照品（批号：GCS137，中国药品生物制品检定所）；皂苷对照品（批号：11041201，中国食品药品检定研究院）；灵芝孢子粉（批号：20110920，分别采购于江苏大丰、吉林长春、山东济宁、山东春江、安徽亳州、
安徽金寨、安徽霍山一品堂）；苯酚（批号：20100715，天津诺克科技发展有限公司）；浓硫酸（批号：20110701，广州化学试剂二厂）；香草醛（批号：20100315，天津市百世化工有限公司）；高氯酸（批号：20100904，天津市百世化工有限公司）；冰醋酸（批号：20090320，天津市百世化工有限公司）；乙醇（批号：20100806，天津市百世化工有限公司），以上试剂均为分析纯。

2结果
2.1葡萄糖对照品溶液的制备与多糖的供试品溶液的制备对照品溶液的制备：取无水葡萄糖对照品约0.01g，精密称定，置100mL容量瓶中，加蒸馏水溶解并稀释至刻度，摇匀，即得浓度为0.1mg/mL的对照品贮备液。

供试品溶液的制备：取灵芝粉末0.5g，精密称定，置索氏提取器中，加水90ml，电加热器加热回流提取5h，提取液转移至100ml量瓶中，加水至刻度，摇匀，精密吸取50ml浓缩至约10ml，加入乙醇150ml，摇匀，4℃放置12h，取出，离心，倾出上清液，沉淀加水溶解并转移至250ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得[5]。

2.2三萜皂苷对照品溶液与总三萜皂苷供试品溶液的制备对照品溶液的制备：取干燥的皂苷对照品6mg，精密称定，置5mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得皂苷对照品储备液。

再精密移取储备液2~10mL量瓶中，加甲醇定容，摇匀，即得浓度为0.2412mg/mL的三萜皂苷对照品溶液。

供试品溶液的制备：取灵芝孢子粉粉末约0.5g，精密称定，置圆底烧瓶中，用50mL三氯甲烷，超声30min，冷凝回流1.5h，滤过，挥干溶剂，用甲醇溶解置25mL量瓶中，定容，摇匀，即得三萜皂苷供试品溶液[6]。

2.3线性关系考察
2.3.1多糖的线性关系考察精密吸取对照品溶液0.10mL，0.15mL，0.20mL，0.25mL，0.3mL分别置于10ml试管中，加入1.0mL的5%苯酚溶液，迅速加入7.0mL浓硫酸，加蒸馏水至刻度，振摇5min，置沸水浴中30min，再冷水浴10min，以蒸馏水为空白对照，在波长492nm处测定各溶液吸光度。

以对照品质量（mg）为横坐标，吸光度（A）为纵坐标，绘制标准曲线。

实验结果显示无水葡萄糖对照品在0.0100~0.0300mg范围内呈良好的线性关系，相关系数r为0.9982，回归方程为Y=0.3961X+0.1837。

2.3.2总三萜皂苷的线性关系考察精密吸取三萜皂苷对照品溶液0.1mL，0.2mL，0.3mL，0.4mL，0.5mL，0.6mL，0.7mL分别置于试管中，水浴蒸干，加入5%的香草醛冰醋酸溶液0.2mL和0.8mL的高氯酸，在60℃下反应15min，冰水冷却，添加5mL冰醋酸，在波长555nm处测定各溶液吸光度。

以对照品质量（mg）为横坐标，吸光度（A）为纵坐标，绘制标准曲线。

实验结果显示三萜皂苷在0.025~0.125mg范围内呈良好的线性关系，相关系数r为0.9996，回归方程为Y=5.8089X+0.011。

2.4精密度试验
2.4.1多糖的精密度考察精密吸取无水葡萄糖对照品溶液1.5mL，按”2.
3.1”项下显色方法显色，连续测定吸光度6次。

结果显示，精密度试验的RSD为1.42%（n=6），提示仪器精密度良好。

2.4.2总三萜皂苷的精密度考察取标准曲线项下0.2495mg/mL三萜皂苷对照品溶液制备的样品0.4mL，按”2.
3.2”项下方法显色，连续测定吸光度5次，求出RSD。

结果显示，精密度测定的RSD为1.40%（n=5），提示仪器精密度良好。

2.5稳定性试验
2.5.1多糖的稳定性考察取药材0.5g，精密称定，按”2.1”项下的供试品制备方法制备溶液，精密量取该供试品溶液0.5mL，加入1.0mL的5%苯酚溶液，迅速加入7.0mL浓硫酸，加蒸馏水至刻度，振摇5min，置沸水浴中30min，再冷水浴10min，在反应后10min，15min，25min，35min，45min，60min，在波长492nm下测定吸光度，结果显示：在60min内6次测定值的RSD为0.26%（n=6），表明溶液在1h内稳定，故本实验可以确定在显色后1h内测定。

2.5.2总三萜皂苷的稳定性考察取药材约0.5g，精密称定，按”2.2”项下的供试品制备方法制备溶液，精密量取该供试品溶液0.2mL，水浴蒸干，加入5%的香草醛冰醋酸溶液0．2mL和0.8mL的高氯酸，在60℃下反應15min，冰水冷却，加5mL冰醋酸，在反应后10min，15min，25min，35min，45min，60min，在波长555nm下测定吸光度，结果显示：在60min内6次测定值的RSD为0.94%（n=6），表明溶液在1h内稳定，故本实验可以确定在显色后1h内测定。

2.6重复性试验
2.6.1多糖的重复性考察取一份药材约0.5g，精密称定，分别精密量取6份供试品溶液0.5mL，按”2.1”项下的供试品制备方法制备溶液，在波长492nm下测定吸光度，按测定数据求出多糖含量，并求算平均含量和RSD。

结果表明药材中多糖含量为5.20mg/g，RSD为0.77%（n=6），提示此实验操作方法的重复性良好。

2.6.2总三萜皂苷的重复性考察取同一样品6份，按”2.2”项下的供试品制备方法制备溶液，在波长555nm下测定吸光度，按测定数据求出各自的总三萜皂苷含量，并求算平均含量和RSD。

结果表明药材中总三萜皂苷含量为 5.06%，RSD为0.29%（n=6），提示此实验操作方法的重复性良好。

2.7加样回收率试验
2.7.1多糖的加样回收率试验精密称取同一批号的样品约0.25g，共6份，分别精密加入对照品储备液2.5mL，按”2.1”项下的供试品制备方法制备溶液，照标
准曲线制备项下的方法，依法显色，测定吸光度，按测定数据求出各自的多糖含量，并得到回收率及RSD。

结果表明平均加样回收率为101.17%，RSD为1.84%（n=6），提示该测定方法回收率良好，准确度高，方法可行。

2.7.2总三萜皂苷的加样回收率试验精密称取，样品共6份，每份样品约0.25g，分别精密加入三萜皂苷对照品12.5mg，按”2.2”项下的供试品制备方法制备溶液，照标准曲线制备项下的方法，依法显色，测定吸光度，按测定数据求出各自的总三萜皂苷含量，并得到回收率及RSD，结果表明平均加样回收率为100.74%，RSD为1.29%（n=6），提示该测定方法回收率良好，准确度高，方法可行，见表1，表2。

2.8测定各批次灵芝孢子粉中多糖、总三萜皂苷的含量
2.8.1灵芝孢子粉中多糖的含量测定灵芝孢子粉粉末（过四号筛）0.5g，精密称定，按”2.1”项中供试品溶液的制备方法制备。

分别精密吸取0.5mL样品溶液至试管中，加入1.0mL的5%苯酚溶液，迅速加入7.0mL浓硫酸，加蒸馏水至刻度，振摇5min，置沸水浴中30min，再冷水浴10min，以蒸馏水为空白对照，在波长492nm处测定吸光度，从标准曲线上读出样品溶液中含多糖的含量，计算其含量。

2.8.2灵芝孢子粉中总三萜皂苷的含量测定分别取各产地灵芝孢子粉粉末约0.5g，精密称定，按”2.2”项中供试品溶液的制备方法制备。

分别精密吸取0.2mL 样品溶液至试管中，水浴蒸干，加入5%的香草醛冰醋酸溶液0.2mL和0.8mL的高氯酸，在60℃下反应15min，冰水冷却，加5mL冰醋酸，在波长555nm处测定吸光度，从标准曲线上读出样品溶液中含总三萜皂苷的含量，计算其含量，见表3。

3讨论
3.1三萜皂苷的对照品的选择国内灵芝孢子粉存在价格昂贵、无统一法定标准等问题，中国药典多以多糖作为质量评价标准，日本以三萜成分灵芝酸作为评价标准。

国内灵芝孢子粉的研究，因无灵芝酸对照品供应，国内多以熊果酸或五环三萜齐墩果酸为对照品，本研究以五环三萜齐墩果酸为对照品，作为测定三萜皂苷含量测定的对照品，为灵芝孢子粉的质量评价提供了新的指标。

3.2不同产地的多糖、三萜皂苷含量结果分析由表3可知，不同产区灵芝孢子粉的多糖、三萜皂苷含量差别较大。

不同产区灵芝孢子粉的三萜皂苷含量由高到低依次为：山东济宁、安徽金寨、山东春江、安徽霍山一品堂、江苏大丰、吉林长春、安徽亳州。

产于山东济宁的灵芝孢子粉中三萜皂苷的含量为5.05%，其三萜皂苷含量为所采集产区中最高。

不同产区灵芝孢子粉的多糖含量由高到低依
次为：安徽霍山一品堂、安徽金寨、山东济宁、江苏大丰、安徽亳州、山东春江、吉林长春。

安徽霍山一品堂产的多糖含量为2.28%，其多糖含量为所采集产区中最高。

不同产地灵芝孢子粉的多糖和三萜皂苷含量存在差异，可能因为地理环境、气候等因素的影响灵芝孢子粉的化学成分。

参考文献：
[1]周莉云.浅析灵芝的药理和功效[J].中国民族民间医药，2013，09（10）：11-12.
[2]唐柳，张志军，魏雪生，等.灵芝孢子粉药理作用研究进展[J].天津农业科学，2011，17（03）：25-28.
[3]张晓云，杨春清.灵芝的化学成分和药理作用[J].国外医药（植物药分册），2006，21（04）：152-155.
[4]赵明文，王晨光，鲍鹏，等.不同灵芝菌丝体中三萜与多糖含量的比较[J].中国食用菌，2003，22（02）：43-46.
[5]白在贤，周雪梅，韩塔娜，等.破壁灵芝孢子粉中多糖的含量测定[J].中国民族医药杂志，2006，4（02）：36-39.
[6]王筱婧，林焕冰，徐江，等.HPLC法和UV-VIS法测定灵芝孢子粉中灵芝三萜及灵芝多糖的含量[J].当代医学，2009，15（31）：128-130.编辑/申磊。