单分子水平高分子相互作用的AFM成像与单分子力谱研究_张文科

原子力 显 微 镜 技 术 （ AFM） 自 从 其 发 明 以 来 被广泛的用于纳米尺度表面形貌的研究． 基于其 不同于传统 方 法 （ 例 如，电 镜 ） 的 成 像 原 理，人 们 不需要将样品进 行 染 色 或 者 标 记，而 直 接 将 待 研 究的目标分子固 定 到 平 整 的 固 体 基 片 表 面，再 利 用其尖锐的探针 在 样 品 表 面 进 行 光 栅 扫 描，最 终 可以得 到 单 个 分 子 （ 甚 至 是 原 子） 的 高 清 晰 图 像［1］． 不 同 于 在 其 之 前 出 现 的 扫 描 隧 道 显 微 镜 （ STM） ，AFM 不 需 要 导 电 的 基 底，而 且 可 以 很 好 地 在 真 空 中 、空 气 中 以 及 水 溶 液 中 实 现 成 像 ，大 大 拓宽了它的应 用 领 域． 从 AFM 发 明 时 起，它 就 被 广泛地应用于生物高分子 （ 尤其是 DNA） 的成像 研究，获得了关于 单 个 生 物 高 分 子 的 构 象 状 态 等 信息［2］． 另 外，通 过 将 两 种 可 以 发 生 相 互 作 用 （ 或 者可以发 生 反 应 ） 的 生 物 大 分 子 （ 例 如，DNA 和 DNA 结 合 蛋 白 ） 混 合，并 将 其 复 合 物 铺 展 到 平 整 的固体基片表面，人 们 可 以 从 分 子 水 平 给 出 二 者 结合模式的信息，通 过 对 反 应 体 系 在 不 同 时 间 段
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* 庆祝沈家骢院士 80 华诞专稿； 2011 -04 -19 收稿，2011 -05 -19 修稿； 国家自然科学基金（ 基金号 20844003 ，20834003 ，20974039 ） 资 助 项 目； ＊＊通讯联系人，E-mail： zhangwk@ jlu． edu． cn doi： 10． 3724 / SP． J． 1105． 2011． 11124
1 AFM 成像研究 DNA 与 DNA 结 合蛋白之间的相互作用
1. 1 空气相静态成像研究 核酸与蛋白质的相互作用贯穿于分子生物学
中心法则的每一 个 环 节，在 单 分 子 水 平 对 这 些 蛋 白质与核酸的作用机理以及相互作用的影响因素 的研究，有助于深化 人 们 对 DNA 复 制 （ 或 者 病 毒 复制、感染 ） 等 重 要 生 命 过 程 发 生 的 分 子 机 理 的 认识，从而为最终实现对 DNA 复制等过程的人为 调控奠定基础．
由于 AFM 还可以实现溶液相成像，所以上面 提到的空气相的研究从理论上来说是可以直接转 移到溶液相来做． 其样品制备的前面几个步骤与 空 气 相 成 像 基 本 一 致 ，只 是 在 吸 附 完 后 ，直 接 用 成 像缓冲液（ 通常含有一定量的二价镁离子或者镍 离子） 润洗后就可以直接用于液相成像． 这样可 以减少空气相成像中样品干燥步骤有可能引起的
静态 AFM 成 像 可 以 直 观 地 给 出 DNA （ 或 者 RNA） 与蛋白 质 间 的 结 合 模 式． 通 过 把 利 用 分 子 生物学方法提纯的 DNA 及蛋白质按照一定配比 在适当的缓冲溶液中混合，让二者形成复合物． 接 着将此复合物的溶液稀释到适合 AFM 成 像 的 浓 度（ 确定标准通常 依 据 样 品 中 DNA 的 终 浓 度，一 般为 1 ～ 2 μg / mL） ，然 后 将 溶 液 滴 加 到 平 整 的 固 体基片表面（ 如云母片 ） 吸 附 一 定 时 间，在 最 终 氮 气干燥样品之前，分 别 用 缓 冲 溶 液 及 纯 水 润 洗 掉 吸附较弱的样品和除掉大部分的无机盐． 如果只 是使用样品缓冲 液 而 不 用 水 来 润 洗 样 品，会 导 致 最终在干 燥 样 品 的 时 候 有 大 量 无 机 盐 的 颗 粒 析 出，干扰成像． 由 于 许 多 DNA 结 合 蛋 在 中 性 溶 液 中都会体现某种 正 电 性，所 以 比 较 容 易 吸 附 到 负 电性的云母片表面． 尽管 DNA 本身呈现负电性， 不易吸附到云母片上，但是其与 DNA 结合蛋白形 成复合物之后就比较容易 实 现 吸 附 了［12］． 对 于 一 些不容易在纯云母上吸附的 DNA-蛋白质复合物， 可以通过利用二价阳离子（ 如 Mg2 + 或 Ni2 + ） 处理 云母片表面（ 或者直接将二价阳离子加入到溶液 中） ． ［13］ 如果担心二价离子的引入干扰 DNA-蛋 白 质复合物的稳定 性，还 可 以 尝 试 采 用 氨 基 硅 烷 化 试 剂 处 理 云 母 片 表 面 ，产 生 正 电 性 的 表 面 ，有 利 于 复 合 物 的 吸 附［14］ ．
DNA 与蛋白 质 在 形 态 上 的 差 异 是 人 们 利 用 AFM 成像研究二者相互作用的基础． 双螺旋 DNA
是一种半刚性的 高 分 子，它 倾 向 于 以 伸 展 的 线 链 状形态存在． 而蛋白质由于其分子链的柔性以及 复 杂 的 分 子 内 相 互 作 用 ，往 往 以 线 团 状 结 构 呈 现 ． 根据蛋白质与 DNA 结 合 模 式 的 不 同 （ 例 如，序 列 特异性与否） ，可以 对 DNA 的 构 象 产 生 不 同 的 影 响． 对于序列 特 异 性 的 蛋 白，AFM 成 像 可 以 给 出 蛋白在 DNA 上的结合位点分布情况． 有些蛋白质 可以通过与 DNA 结合将 2 条 DNA 链段拉近形成 环状（ loop） 、盘 状 （ disk ） 、或 者 轨 道 状 复 合 结 构， 如图 1 所示． 图 1（ a） 是一种具有序列专一性 DNA 结合蛋白（ HPV E2） ［13］，通过调控 E2 蛋白可以识 别的 DNA 序 列 （ E2BS） 在 长 链 DNA 模 板 上 的 位 置，可以直接从 AFM 图像判断该蛋白是否与此种 DNA 结合并依靠蛋白间的相互作用成环． 实验发 现天然型 HPV E2 蛋 白 能 够 结 合 目 标 DNA 片 段 上的 2 个结合位 点，而 且 还 可 以 通 过 蛋 白 二 聚 体 的形成进一步将 该 DNA 片 段 环 化，见 图 1 （ a） 中 间的 3 个图片． 而该蛋白的 3 个突变体却只具有 DNA 结合能力 （ 见图 1 （ a） 底部一 行 图 片 中 的 箭 头所示） 但 没 有 将 DNA 环 化 的 能 力． 类 似 的，对 于没有序 列 选 择 性 的 DNA 结 合 蛋 白，AFM 成 像 也可以较直观地给出他们的结合模式． 比如，枯草 芽胞杆菌的 DnaD 蛋白可以与环状（ 质粒） 或者线 链型双链 DNA 结 合，并 产 生 结 合 诱 导 的 蛋 白 聚 集，从而形 成 了 圆 盘 状 的 复 合 物，如 图 1 （ b ） 所 示［12］． 而 该 DnaD 蛋 白 的 羧 基 端 结 构 域 （ Cdomain） 却体现出了与天然全蛋白不同的 DNA 结 合性质，它只是在 DNA 片段局域形成了小的聚集 体，如图 1 （ c） 所 示［15］． 此 外，枯 草 芽 胞 杆 菌 中 另 外一种引发 体 蛋 白 DnaB 具 有 将 两 条 DNA 片 段 桥连起来形成类似铁轨状 排 列 的 结 构［12］． 尽 管 其 它的生物化学方法（ 例如，电泳） 也可以给出 DNA 是否与蛋白质的结合信息，但是 AFM 以其很少的 样品用量以及可以直观给出单分子状态（ 而不是 统计平均 ） 的 信 息 等 优 点，成 为 人 们 表 征 这 两 种 生物大分子相互作用的重要手段． 1. 2 原位动态成像研究
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高分子学报
2011 年
剂极性、pH 值 ） 等 之 间 的 关 系，高 分 子 在 液 固 界 面的吸附与解吸 附，生 物 大 分 子 多 聚 糖 在 外 力 诱 导下的椅-船式 构 象 转 变，蛋 白 质 的 解 折 叠，DNA 的熔融解链 等［4 ． ～ 8］ 除 了 高 分 子 单 个 链 弹 性 行 为 的研究之外，力谱 还 广 泛 用 于 各 种 分 子 间 弱 相 互 作用的 直 接 测 量，包 括 π-π 相 互 作 用，协 同 多 价 作用，互补 DNA 链段之间的结合强度等［9 ． ～ 11］
取样并成像分析，可以得到反应动力学信息． 由于 AFM 可以在接近生理环 境 条 件 下 工 作，人 们 甚 至 可以用它来原位 检 测 单 分 子 水 平 的 酶 促 反 应，揭 示了许多生物学 过 程 的 分 子 机 理［2］． 作 为 一 种 有 效的单分子成像手段，AFM 可 以 直 观 地 展 示 分 子 间作用模式以及发生过程． 但是，与其他成像技术 一样，我们无法从 AFM 图像中得到分子间或分子 内相互作用的定量信息． 为此人们又在 AFM 技术 的基础上专门开发出了用于检测微小力的实验方 法———单 分 子 力 谱 （ single-molecule force spectroscopy，SMFS） ． ［3］ 通 过 将 待 研 究 的 分 子 桥 连到 AFM 的针尖及固体基片之间，然后对其进行 Z 方向的拉伸 操 纵，可 以 直 接 测 得 单 个 高 分 子 链 的弹性以及分子内及分子间的相互作用强度． 迄 今为止，人们利用 AFM 单分子力谱技术获得了许 多有关外力诱导下单个聚合物分子的构象转变机 理 ，例 如 无 规 线 团 结 构 的 的 熵 弹 性 ，高 分 子 单 链 弹 性与取代基、立构 规 整 性 以 及 溶 液 环 境 （ 例 如，溶
第9期 2011 年 9 月
高分子学报
ACTA POLYMERICA SINICA
No． 9 Sep． ，2011
·专论·
单分子水平高分子相互作用的 AFM 成像与单分子力谱研究*
张文科 ＊＊
（ 吉林大学化学学院 超分子结构与材料国家重点实验室 长春 130012）
摘 要 结合作者近期的研究工作，重点介绍了如何把原子力显微镜（ AFM） 成像及单 分 子 力 谱 结 合 （ 包 括 原 位结合或者离位结合） 起来，研究高分子之间的相互作用． 本文涉及 生 物 高 分 子 （ 主 要 是 核 酸-蛋 白 质 体 系 ） 以 及合成高分子体系（ 如 聚 氧 乙 烯，PEO） 的 相 关 研 究 工 作． 对 于 生 物 高 分 子 体 系，主 要 以 长 链 核 酸 （ 如 双 螺 旋 DNA 及 RNA） 为探针，首先利用 AFM 成像（ 包括静态 AFM 成像及 溶 液 中 原 位 成 像 ） 考 察 了 蛋 白 与 DNA 结 合 后对 DNA 拓扑构象的影响规律； 接着讲述利用 AFM 单分子力谱揭示双螺旋 DNA 外力诱导下构象转变的本 质以及利用双螺旋 DNA 的力学指纹 谱 来 研 究 蛋 白 质 结 合 对 指 纹 谱 的 影 响 规 律 ，从 而 揭 示 DNA 结 合 蛋 白 对 DNA 动态构象的影响规律． 同时还尝试将此方法用于研究完整病毒（ 烟草花叶病毒） 颗粒中 RNA 与蛋白质外 壳间的相互作用，拓展 AFM 单分子力谱方法在相对复杂生物体系中核酸与蛋白相互作用研究中的应用． 对于 合成高分子体系，主要讲述了如何利用 AFM 成 像 及 单 分 子 力 谱 来 研 究 高 分 子 凝 聚 态 （ 这 里 主 要 是 高 分 子 单 晶） 中的分子间相互作用． 选取了 PEO 为 研 究 对 象，首 先 利 用 AFM 成 像 来 定 位 高 分 子 单 晶 中 的 单 个 聚 合 物 链，然后将该聚合物链从其单晶中提拉出来直接定量测得 高 分 子 单 晶 中 的 分 子 间 相 互 作 用 强 度 等 信 息 ． 这 些 定量的分子间、分子内相互作用信息对于揭示 DNA 复制 等 重 要 生 命 过 程 的 分 子 机 理 以 及 高 性 能 高 分 子 材 料 的分子设计具有重要意义． 关键词 原子力显微镜，单分子力谱，核酸-蛋白质相互作用，聚合物单晶