第五章 核酸的分离纯化

第五章核酸的分离纯化

核酸分离纯化的原则:

保持核酸一级结构的完整性

尽可能提高核酸制品的纯度

DNA与RNA在分子大小、理化性质等方面不同分离方法存在差异。

DNA和RNA是生物体中最重要的核酸分子，是分子生物学和分子诊断的研究对象

DNA和RNA的分离与纯化技术是分子生物学研究中重要的基本技术。

核蛋白：核酸+蛋白质

DNP：DNA+蛋白质

RNP：RNA+蛋白质

第一节核酸分离纯化的设计及原则

（一）材料与方法的选择

不同的研究目的对核酸的完整性、纯度、

产量及浓度有不同的要求。

⏹需考虑制备核酸所需的时间与成本

⏹应选择安全的试剂与制备方案

（二）选择原则

1.保持核酸碱基序列的完整性

2.尽量清除其它分子的污染，保证核酸纯度

3.保持核酸的完整性

尽量简化分离纯化步骤，缩短提取时间

尽量避免各种有害因素对核酸的破坏

二、技术路线的设计

（一）核酸的释放

DNA和RNA均位于细胞内（病毒除外），因此核酸分离与纯化的第一步即是裂解细胞、释放核酸。

（二）核酸的分离与纯化

应该清除的杂质主要包括:

1.非核酸的大分子污染物

蛋白质、多糖及脂类物质等

2.非需要的核酸分子

分离某一核酸分子时，其它核酸皆为杂质

3.加入的有机溶剂和某些金属离子

（三）核酸的浓缩、沉淀与洗涤

沉淀是浓缩核酸最常用的方法

常用的盐类:醋酸钠、醋酸钾、醋酸铵、氯化钠、氯化钾及氯化镁

常用的有机溶剂:乙醇、异丙醇和聚乙二醇

核酸沉淀常常含有少量共沉淀的盐，需用70%～75%的乙醇洗涤去除

三、核酸的鉴定与保存

（一）核酸的鉴定

1.浓度鉴定

（1）紫外分光光度法：

核酸分子中的碱基具有共轭双键结构，可以吸收紫外线，其最大吸收波长为260nm。

DNA或RNA的定量

OD260=1.0相当于：

50μg/ml双链DNA

40μg/ml单链DNA（或RNA）

33μg/ml寡核苷酸

适用于>0.25μg/ml的核酸溶液

（2）荧光光度法：

A:溴化乙锭（EB)

核酸的荧光染料溴化乙锭（EB)嵌入碱基平面后，本身无荧光的核酸在UV 激发下发出红色荧光。凝胶电泳中荧光强度的积分与溶液中核酸的含量呈正比。该法灵敏度可达1ng～5ng，适合低浓度核酸溶液的定量分析。

注：溴化乙锭（EB）是一种强致癌剂。使用时必须戴手套操作。

B、Sber Green I

与dsDNA亲和力较高，结合后荧光强度大大增强，特别适用于对溶液dsDNA 的检测、分析。特点为：

灵敏度高，至少可检出20pg dsDNA分子。高于EB 25~100倍。

受ssDNA、RNA及其他物质的影响小。

对Taq酶、逆转录酶、内切酶、T4连接酶没有抑制作用。

C、GoldView(GV)

GoldView(GV)作为一种新的超灵敏荧光染料，可以从琼脂糖凝胶中检出低于

20pg的双链DNA。

GoldView(GV)是一种可代替溴化乙锭（EB）的新型核酸染料，使用方法与之完全相同，在100ml琼脂糖胶溶液中加入5µl GoldView™即可。在紫外透射光下双链DNA呈现绿色荧光，也可用于染RNA。

通过Ames试验、小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验、小鼠睾丸精母细胞染色体畸变试验，致突变性结果均为阴性。

通过凝胶电泳回收DNA片段时，建议使用GoldView染色，在自然光下切割DNA条带，避免紫外线与EB对目的DNA产生的损伤，可明显提高克隆、转化、转录等分子生物学下游操作的效率。

虽然未发现GoldView有致癌作用，但对皮肤、眼睛会有一定的刺激，操作时应戴上手套。

2.纯度鉴定

（1）紫外分光光度法：

主要通过A260与A280的比值来判定有无蛋白质等的污染。比值升高或降低均提示制备的核酸纯度不佳。

判断核酸样品的纯度

DNA纯品: OD260/OD280 = 1.8

RNA纯品: OD260/OD280 = 2.0（1.8~2.1）

当DNA样品中含有蛋白质、酚或其他小分子污染物时，会影响DNA吸光度的准确测定。一般情况下同时检测同一样品的OD260、OD280，计算其比值来衡量样品的纯度。

经验值：

纯DNA：OD260/OD280≈1.8(＞1.9,表明有RNA污染；＜1.6，表明有蛋白质、酚等污染）

纯RNA：1.7 ＜OD260/OD280＜2.0（＜1.7时表明有蛋白质或酚污染；＞2.0时表明可能有异硫氰酸残存）

若样品不纯，则比值发生变化，此时无法用分光光度法对核酸进行定量，可使用其他方法进行估算。

另外，鉴定RNA纯度所用溶液的pH值会影响A260/A280的读数。如RNA在

水溶液中的A260/A280比值就比其在Tris缓冲液（pH 7.5）中的读数低0.2～0.3。荧光光度法：

EB等荧光染料示踪的核酸电泳可判定核酸制品的纯度。

3.完整性鉴定

琼脂糖凝胶电泳：

以EB为示踪剂的核酸凝胶电泳可判定核酸制品的完整性

基因组DNA如果发生降解，电泳图呈拖尾状

完整的或降解很少的总RNA电泳图谱

中，三条带荧光强度应呈特定的比值。

⏹沉降系数大，电泳迁移率低，

荧光强度高

⏹沉降系数小，电泳迁移率高，

荧光强度低

⏹28S（或23S）RNA的荧光强度

一般约为18S（或16S）RNA

的2倍，否则提示有RNA的降解

⏹若在点样孔附近有着色条带，提示可能存在DNA的污染

（二）核酸的保存

1.DNA的保存

溶于TE缓冲液中的DNA在-70℃冰箱可保存数年。

TE的pH值为8.0时，可减少DNA的脱氨反应；

低于7.0时DNA容易降解。

EDTA：螯合Mg2+、Ca2+等可抑制DNA酶的活性；

低温保存：-4 ℃；-20 ℃；-70 ℃

加少量氯仿：有效避免细菌与核酸的污染。

2.RNA的保存

RNA溶于H2O或0.3mol/L的NaAc溶液中，-70℃保存

RNA溶液中加入RNasin或VRC，可延长保存时间

用于配置试剂及溶解RNA的H2O均应经DEPC处理