超分辨率显微镜

3D生长恢复极性生长, 生长因子受体相关调节通路； 2D细胞无极性 3D 和 2D 基 因 表 达 不 同 3D胞外机制调节细胞 生长，2D无 3D细胞形成三维立体 结构，2D无 3D基质诱导细胞分化 细胞外基质物理支持
基因表达
细胞外基质，荷尔蒙和粘附分子不同
生长
细胞生长分化因子和凋亡相关基因不同
形态发生
胞外机制，粘附分子，生长因子受体
分化
胞外机制，生长因子，运动分子
研究现状
Year 2004 2005 2006 Achievements •微环境下肿瘤细胞基因选择性改变 •肿瘤细胞类型的转换以及相关的信号途径 • 肿瘤细胞逃避凋亡的生物学途径 • 微环境中可以促进肿瘤发生的生物学因子 •3D结构研究乳腺癌的发生和基因的表达谱改变的关系 •3D组织研究肿瘤细胞生长发生，信号传导，迁移运动和形态发生 3D
2007 •模拟胞生长微环境，提供独特的研究视角 2008 •建立前列腺表皮细胞的3D模型，研究前列腺癌症的PI3K通路 2009 2010 •运用3D组织模型研究DNA的损伤，修复，细胞周期进程 •3D组织旁效应研究，微核、DNA损伤蛋白表达 •3D组织旁效应研究中microRNA的作用
3KT Matrigel 3KT Matrigel
Science, 2003
双色荧光超分辨率成像 光激活定位系统（photoactivated localization microscopy， PAL) PA—GFP荧光蛋白需要用405nm的激光激活一段时间 后才可以观察到488激发出的绿色 荧光。
PNAS December 18, 2007
随机光学重构技术（stochastic optical reconstruction microscopy, STROM）Cy荧光染料分子可以在激发态 和暗态之间转换。561nm的激发光可以激活Cy5分子， 长时间照射可以将其转换为暗态。用488nm的激发光 照射Cy5分子可以 使其从暗态转换成荧光态。过程长 短依赖于第二个荧光分Cy3与Cy5之间的距离。
z平面轴向的超分辨率显微技术
三维的PALM/STORM：散光原理成像（50nm）；液晶空间 光调制器(spatial light modulator, SLM ，10—20nm)；多重 平面成像（75nm）
柱面镜
网格蛋白
8 FEBRUARY 2008 SCIENCE
三维SSIM 成像：三维结构性照明成像的原理与二维结构 性照明成像的原理是一致的，其区别是在原来的两束干涉 光的基础上又加了一束干涉光束，来产生z 轴方向的干涉 模式，提取z 轴的信息。分辨率达到xy 平面100 nm左右， z 轴方向上200 nm 左右，成像深度能力较好。
超分辨率显微镜作为生 物学工作者的眼睛让我 们看到了更微观的世界， 但实际应用中仍需进一 步发展和完善……
J. Cell Biol. Vol. 190 No. 2 165–175
谢谢
Nature methods VOL.6 NO.1 JANUARY 2009
XY平面上超分辨率显微技术 平面上超分辨率显微技术 单分子荧光成像：视野下仅单个荧光分子的时候， 单分子荧光成像：视野下仅单个荧光分子的时候，通过特 定的算法拟合， 定的算法拟合，此荧光分子的位置精度可以很容易超过光 学分辨率极限，达到纳米级。 学分辨率极限，达到纳米级。
Activator-reporter 荧光染料选择
Current Opinion in Chemical Biology 2008, 12:505–514
SCIENCE SEPTEMBER 2007
受激发射损耗显微技术（stimulated emission depletion， STED）：当特定的荧光分子被比激发波长长的激光照射 时，可以被强行猝灭回到基准态 ，利用荧光分子的这一特 性来减少激发光的光斑大小，从而直接减少点扩散函数的 半高宽来提高分辨率。
3D组织辐射旁效应研究
吴汝群 2011.11.20
二维和三维组织辐射旁效应差异性研究 辐射源：X射线 重离子（12C6+） 实验材料：三维肺囊 单层细胞 终点检测：γH2AX MN γ
意义
微环境中影响细胞行为的因素
2D和3D环境中细胞形态 和 环境中细胞形态
生物功能
2D与3D差异
调节机制
细胞形状
Nature methods VOL.6 NO.1 JANUARY 2009
JCB • VOLUME 190 • NUMBER 2 • 2010
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分辨率限制 光学显微镜的分辨率定义：用显微镜可以分辨出来的两个 同等亮度的点光源之间的最小距离，光的衍射特性所决定 的。 △x, △y= λ/2nsinα = λ/2NA, △z= 2λ/nsin2α.x、y向分辨率 极限200nm，Z向分辨率极限500nm。 点扩散函数（point spread function，PSF）
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0Gy
5Gy
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5 4.5 4 3.5 3 2.5 2 1.5 1 0.5 0
0Gy
2Gy
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2D
3D（5d)
3D (10d)
2D
3D（5d)
3D (10d)
X 射线旁效应γH2AX foci数量
35 30
12C6+离子旁效应γH2AX foci数量
35源自文库
0Gy 5Gy
﹡
30
0Gy 2Gy
MN/1000 cells
Nature methods JANUARY 2009
微管蛋白 3D动画 （3D SSIM）
Nature Methods (2011), Received 03 August 2011 Accepted 21 September 2011 Published online 16 October 2011
超分辨率总结
J. Cell Biol. Vol. 190 No. 2 165–175
商业超分辨率显微镜分辨率比较
J. Cell Biol. Vol. 190 No. 2 165–175
超分辨率显微镜应用所面临的挑战：xyz方向分辨率提高的 同时，需要满足日常使用的需求，如活细胞内实时观测， 3D分层扫描，结果处理软件 标准化，荧光染料选择，生 物样品准备等。
IMR 90
5 days
3KT单层细胞形态 单层细胞形态 单层细胞
肺囊结构培养示意图 3D肺囊团 肺囊团
受体细胞γH2Ax 受体细胞γ
共培养实验方案设计示意图
受体细胞 MN
5 4.5 4 3.5 3 2.5 2 1.5 1 0.5 0
γ H 2AX foci per cell
γ H2AX foci per cell
25 20 15 10 5 0 3D(5d) 3D(10d)
M N /1000 cells
25 20 15 10 5 0 3D(5d) 3D(10d)
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X射线辐射诱导旁效应微核效应
12C6+离子辐射诱导旁效应微核效应
以肺上皮细胞构建的三维肺囊，形态与单层细胞 存在明显不同。 gH2AX在3D组织旁效应中都可诱导形成。10天的 foci 5 肺囊诱导的foci略少于5天的肺囊。 相同基因系的2D单层细胞诱导的gH2AX foci形成 率高于3D。 3D组旁效应织微核诱导形成率随培养时间存在差 异，10天的少于5天。
NATURE ，13 April 2006
饱和结构照明显微技术(saturated structure illumination microscopy, SSIM) ：非线性结构性光学照明部件引入到传 统的显微镜，多重相互衍射的光束照射到样本上，然后 从收集到的发射光模式中提取高分辨率的信息。
PNAS September 13, 2005