盐酸博安霉素脂质体的制备及表征

盐酸博安霉素脂质体的制备及表征
王金晶;张芹;肖晗;陈立江;李丽;张文君;李铁福;刘宇
【摘要】目的探讨制备方法对博安霉素脂质体包封率的影响,考察其制备的影响因素,优化处方工艺,并对其特性进行表征.方法分别采用乙醇注入法和逆向蒸发法制备博安霉素脂质体(boanmycin liposomes,BAM-Ls),确定最终工艺及处方.并对其包封率、粒径、Zeta电位和形态进行综合评价.结果逆向蒸发法制备BAM-Ls时药物包封率明显高于乙醇注入法,最终处方磷脂浓度为10mg/mL、磷脂胆固醇比为4:1(W/W)、水/乙醚比为1:3(V/V)时,所得脂质体包封率最高,约为30％.粒径为150nm,Zeta电位为-22.8mV,7d内脂质体稳定性良好.结论逆向蒸发法制备的BAM-Ls理化性质及稳定性良好.
【期刊名称】《中国抗生素杂志》
【年(卷),期】2014(039)003
【总页数】5页(P220-223,233)
【关键词】博安霉素;乙醇注入法;逆向蒸发法;脂质体
【作者】王金晶;张芹;肖晗;陈立江;李丽;张文君;李铁福;刘宇
【作者单位】辽宁大学药学院,沈阳110036;湖北省钟祥市中医院妇产科,钟祥431900;辽宁中医药大学经济管理学院,沈阳110032;辽宁大学药学院,沈阳110036;辽宁大学药学院,沈阳110036;辽宁大学药学院,沈阳110036;沈阳药科大学制药工程学院,沈阳110016;辽宁大学药学院,沈阳110036
【正文语种】中文
【中图分类】R978.1
博安霉素(boanmycin，BAM)，是从我国浙江平阳土壤中分离得到的轮枝链霉菌
平阳新变种产生的抗癌有效物质，其化学结构与国外报道的博莱霉素
A6(bleomycin A6, BLM A6) 完全一致，属博莱霉素类抗肿瘤抗生素。

为我国自
行研制开发的国家Ⅰ类新药，2002年，以冻干粉形式正式上市销售。

BAM分子式为C60H96N20O21S2·nHCl，分子量1497.66，极易溶于水，溶于
甲醇，不溶于乙醚、氯仿、丙酮等有机溶剂。

在BAM对原发性肝癌的II期103
例临床研究中，单药介入有效率30.8%，联合用药介入有效率42.1%，表明BAM 对肝癌具有较为显著的疗效[1-4]。

目前，除博安霉素冻干粉制剂，尚未见其它剂
型的研究报道。

临床研究表明，其肌注后吸收迅速，血药达峰的时间18.6min，
血药浓度0.20μg/mL，240min后降为零，主要毒副反应表现为肺纤维化。

大剂
量使用时，易造成大鼠肾脏损伤，肾功能生化指标异常升高以及组织形态学病变。

将其制成脂质体制剂，利用脂质体对药物的保护作用，延长其在体内的转运时间，提高生物利用度。

同时，利用脂质体的被动肝靶向性，提高药物在肝脏的分布浓度，降低对其它组织器官的毒副作用。

1.1 药品与试剂
注射用博安霉素冻干粉(辽源市迪康药业有限责任公司，纯度74.5%)；博安霉素对照品(辽源市迪康药业有限责任公司，纯度78.6%)；大豆卵磷脂(EPCS，德国Lipoid公司，纯度98%)；胆固醇(Chol，天津市博迪化工有限公司)；曲拉通(Triton X-100，上海源叶生物科技有限公司)；其余试剂均为分析纯。

1.2 仪器
PB-10型pH计(德国赛多利斯股份公司)；FA1004N电子天平 (上海精密科学仪器有限公司)；Scientz-11D型超声波细胞粉碎机(新芝生物科技股份有限公司)；L-7110高效液相色谱仪(日本日立公司)；N-1000型真空旋转蒸发仪(上海爱朗仪器
有限公司)；DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器(巩义市予华仪器有限公司)；
CS120GXL超速离心机(日本日立公司)。

2.1 博安霉素脂质体的制备
乙醇注入法：将EPCS和Chol溶于20mL乙醇中，在一定温度下，注入到10mL 快速搅拌的BAM水溶液中，减压蒸发除去乙醇后，定容至10mL，超声波细胞粉碎机处理4min，分别过0.8及0.45μm微孔滤膜，即得BAM-Ls溶液。

逆向蒸发法：精密称取处方量的EPCS和Chol溶于10mL氯仿中，超声溶解，减压蒸发成膜，加入无水乙醚30mL，震荡溶解，取BAM适量溶于10mL蒸馏水中，将其加入上述乙醚溶液中，超声波细胞粉碎机处理2min，得到均一溶液，减压蒸发至乙醚完全挥散，蒸馏水定容至10mL，超声波细胞粉碎机处理4min，分别过0.8及0.45μm微孔滤膜，得到BAMLs溶液。

2.2 HPLC分析方法[5-6]
色谱柱：Agilent Eclipse XDB-C18(150mm×4.6mm, 5μm)；
流动相：水相：有机相=72:28(水相：0.055 M乙烷磺酸钠溶液，加入0.08 M醋酸，混匀后用氨水调pH至4.3；有机相：甲醇-乙腈=3:1)；
流速：1.0mL/min，检测波长：291nm；进样量：20μL。

2.3 博安霉素标准曲线的制备
精密称取BAM对照品13.2mg于10mL量瓶中，加蒸馏水定容，混匀，BAM最终浓度约为1mg/mL, 作为BAM储备液。

精密量取储备液适量，以蒸馏水稀释至浓度依次为30，60，120，240和480μg/mL的溶液，分别吸取20μL上述溶液注入到色谱仪中，测定药物峰面积。

并以峰面积(A)对质量浓度(C)作线性回归，回归方程为A=10328C-118948，(r=0.9999)，结果表明BAM在浓度范围30～480μg/mL范围内线性关系良好。

2.4 博安霉素脂质体包封率的测定
精密量取BAM-Ls 4.0mL，于55000r/min离心1h，取上清液HPLC法测定游离药物浓度。

另取BAM-Ls 1.0mL，加入10% Triton X-100的70%乙醇水溶液定
容至5mL，水浴超声至溶液澄清透明，HPLC法测定脂质体溶液药物浓度，包封
率计算按照Eq 2-1计算
其中Ci为未被脂质体包封的游离药物量(或浓度)，Ct为总的药物量(或浓度)。

2.5 博安霉素脂质体粒径、Zeta电位的测定
将制得的BAM-Ls用去离子水适当稀释，置纳米粒度测定仪的石英测量池和毛细
管小池中，分别测定其粒径和Zeta电位，每份样品平行测定3次。

3.1 乙醇注入法制备BAM-Ls的影响因素考察
3.1.1 EPCS浓度考察
在确定了BAM-Ls的处方构成以后，接下来对EPCS的浓度进行了筛选，并采用
乙醇注入法分别制备不同磷脂浓度的脂质体，包封率结果见图3。

3.1.2 EPCS与Chol比例考察
将EPCS浓度固定为20mg/mL，分别考察EPCS和Chol之间比例对包封率的影响，结果见表1。

结果表明，当EPCS/Chol比为4:1时，包封率最高，故按照此比例进行后续试验。

3.1.3 水相与有机相比例考察
EPCS浓度为20mg/mL时，考察水相与有机相乙醇的比例对包封率的影响，结果见图1。

结果表明，水相和乙醇的比例对药物包封率影响较大，由图1可知，当二者比例
达到1:1时，包封率达到最大值。

3.1.4 搅拌速度的影响
当EPCS浓度为20mg/mL，乙醇和水相体积比1:1时，考察搅拌速度对药物包封率的影响，结果见图2。

结果显示，在转速在300～600r/min之间变化时，药物包封率波动不大，故认为磁力搅拌速度对包封率无明显影响。

3.2 逆向蒸发法制备BAM-Ls
试验中逆向蒸发法的工艺条件按照文献[7]中的最优化条件进行，在乙醚和水相体
积比3:1时，分别考察了不同磷脂浓度对包封率的影响。

结果见图3。

由结果可以看出，逆向蒸发法对药物的包封率显著高于乙醇注入法，由此可见，同乙醇注入法相比较，使用逆向蒸发法更适用于水溶性药物的包封，这也与相关文献报道的结果相符[8]。

3.3 博安霉素脂质体的表征
使用逆向蒸发法，按优化后的处方制备BAMLs，并考察其表征。

3.3.1 粒径、Zeta电位测定
按“2.5”项下方法，测得BAM-Ls的平均粒径为(153±2.3)nm，Zeta电位为(-22.8±1.11)mV。

3.3.2 脂质体形态观察
将制备的脂质体用蒸馏水适当稀释，取一滴于专用铜网上，静置后用 3%磷钨酸负染色，用滤纸吸去多余的染色液后，透射电镜观察粒子形态，结果见图4。

由图4可见，BAM-Ls为球形粒子且呈单分散分布，粒径范围小于200nm，且其外观圆整，大小均匀，且可以清晰地观察到所制备脂质体为单室结构。

3.3.3 稳定性考察
将制备的BAM-Ls于0～4°C冰箱保存，分别在第0、1、2、3、4、5、6和7d
取样测定包封率和粒径变化，结果见表2。

4 讨论
脂质体的制备方法众多，从最初的薄膜分散法到新近产生的单相溶液冻干法。

在制备某一药物的脂质体制剂时，首先要考虑该药物的理化性质，主要包括分子量(MW)、溶解度(S)、油水分配系数(logP)、电离常数(pKa)。

博安霉素极易溶于水，
属于分步电离的弱碱性药物，其电离常数pKa＞7.4、4.7和2.7。

本文首先采用被动载药法-乙醇注入法尝试制备BAMLs，该方法对BAM的包封率极低(小于10%)。

Jaafar-Maalej[8]等研究了乙醇注入法对制备水溶性药物(阿糖胞苷)和脂溶性药物(丙酸倍氯米松)脂质体的包封率比较。

他们使用乙醇注入法制备脂质体粒径范围在80～170nm。

结果表明，磷脂和胆固醇的量显著影响药物包封率。

对制备工艺进
行单因素考察后，脂溶性药物包封率接近100%，而水溶性药物仅为16%。

但乙
醇注入法凭借其操作简单、重现性好、避免了使用有机溶剂，易于实现大量生产等特点，还是制备成为了制备脂质体制剂的首选方法之一。

1978年Szoka等提出逆向蒸发法[7]，研究人员通过该方法制备出了内水相体积
大且包封率高的脂质体，其水相体积比小单室脂质体高30倍。

该方法的提出，实现了对大多数水溶性药物的包封，并显著提高药物的包封率。

逆相蒸发法的是脂质体领域里一个里程碑式的重大发现，其制备的大单室脂质体尤其适用于水溶性药物包封。

有机相和水相比例在3:1时，包封率最高。

在制备过程中，磷脂浓度较低时，很难看到明显的凝胶态形成，当磷脂浓度较高时，能够观察到凝胶态的产生，但是并未观察到凝胶层的塌陷。

脂质体的制备与圆底烧瓶的大小、水相和有机量的体积比、真空度等因素均有很大关系。

实验表明，逆向蒸发法制备的脂质体粒径差异较大，每次制备后都需测定粒径。

粒径范围在300～1000nm之间不等。

当磷脂浓
度过大超过60mg/mL时，制备出的脂质体粘度较大，不能完全转移，同时过膜
困难，会造成磷脂较大损失，导致包封率下降。

脂质体的粒径大小和形态也能够影响药物的包封率，对于水溶性药物，粒径大的脂质体的内水相容积大，包封药物较多。

一般常用的减小粒径的方法主要有超声法和高压均质法。

本研究中尝试使用微射流减小脂质体粒径，结果表明，经过微射流次数不同时，脂质体粒径上下波动较大。

将制备的脂质体经过微射流10～15次时，能够得到粒径较为均匀的脂质体溶液，但是由于实验室样品量较少，故本研究中采
用了超声法。

然而探头式超声时间过长造成局部过热，会引起脂质的降解，所以试验中采用将样品放在冰浴中以适当功率进行操作。

【相关文献】
[1] Klees R F, Salasznyk R M, Vandenberg S,et al. Laminin-5 activates extracellular matrix production and osteogenic gene focusing in human mesenchymal stem cells[J].Matrix Biol, 2007, 26(2): 106-114.
[2] 冯奉仪，周立强. 国产一类抗癌新药盐酸博安霉素Ⅱ期临床研究[J]. 中国医学科学院学报, 1999, 21(4): 247-251.
[3] 汤昊, 杨小平. 博安霉素诱导人食管癌Eca-109细胞凋亡及其对细胞周期的影响[J]. 癌症, 2002, 21(8): 855-859.
[4] 冯奉仪, 周立强, 马金兰, 等. 国产一类抗癌新药盐酸博安霉素Ⅰ期临床研究[J]. 中国医学科学院学报, 1996, 18(2): 143-146.
[5] Liu Y, Yoo S D, Fang L,et al. Determination of boanmycin in pharmaceutical preparations by a simple and rapid ion-pair LC method[J].Chromatographia, 2009, 70: 643-646.
[6] Liu Y, Yoo S D, Fang L,et al. Ion-pair LC–UV method for the determination of boanmycin in mouse plasma and its application to a pharmacokinetic
study[J].Chromatographia, 2010, 72: 357-359.
[7] Szoka F J, Papahadjopoulos D. Procedure for preparation of liposomes with large internal aqueous space and high capture by reverse-phase evaporation[J].Proc Natl Acad Sci USA, 1978, 75(9): 4194-4198.
[8] Jaafar-Maalej C, Diab R, Andrieu V,et al. Ethanol injection method for hydrophilic and lipophilic drug-loaded liposome preparation[J].J Liposome Res, 2010, 20(3): 228-243.。