单增李斯特氏菌磷脂酶C(lm-plcB)基因的克隆表达及其在油脂脱胶中的应用

单增李斯特氏菌磷脂酶C(lm-plcB)基因的克隆表达及其在油

脂脱胶中的应用

余榛榛;常明;刘睿杰;金青哲;刘元法;王兴国

【摘要】在大肠杆菌中克隆表达单增李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)磷脂酶C,并进行发酵优化.当接种量为4％时,37℃,200 r/min培养2h后添加2.5 g/L 乳糖,25℃摇瓶诱导发酵26 h,最终获得重组磷脂酶C的活力达到754.6 U/mL.利用该重组磷脂酶C对大豆毛油和菜籽毛油进行脱胶,精炼油中的含磷量分别从216.67mg/kg和183.70 mg/kg下降到3.70 mg/kg和4.50 mg/kg,说明该重组磷脂酶C能够用于不同植物毛油脱胶,可以达到后续精炼工艺要求,同时增加毛油精炼率,在油脂脱胶工艺方面具有较大的应用前景.

【期刊名称】《食品与发酵工业》

【年(卷),期】2013(039)012

【总页数】6页(P44-49)

【关键词】磷脂酶C;单增李斯特氏菌;重组表达;油脂脱胶

【作者】余榛榛;常明;刘睿杰;金青哲;刘元法;王兴国

【作者单位】食品科学与技术国家重点实验室食品安全与营养协同创新中心江南大学食品学院,江苏无锡,214122;食品科学与技术国家重点实验室食品安全与营养协同创新中心江南大学食品学院,江苏无锡,214122;食品科学与技术国家重点实验室食品安全与营养协同创新中心江南大学食品学院,江苏无锡,214122;食品科学与技术国家重点实验室食品安全与营养协同创新中心江南大学食品学院,江苏无

锡,214122;食品科学与技术国家重点实验室食品安全与营养协同创新中心江南大学食品学院,江苏无锡,214122;食品科学与技术国家重点实验室食品安全与营养协同

创新中心江南大学食品学院,江苏无锡,214122

【正文语种】中文

单核细胞增多性李斯特菌(L. monocytogenes，简称Lm)是一种重要的食源性致

病菌，兼性厌氧。温度适应性很强，-20℃时仍可部分存活，巴氏消毒也不能完全灭活。菌株对营养要求不高，能在物体表面形成生物膜对抗菌物质有抵抗作用，抗逆性较强，包括耐酸，耐反复冻溶，耐干燥以及耐盐［1］。Lm 在自然界中广泛

存在，易在野生动物、家畜、鸟类、昆虫、污水、土壤和植物中生长，相关产品如牛、羊、家禽、乳制品、水果、蔬菜、熟肉制品、海产品中也常能检测到该菌。

研究表明，磷脂酶C(Phospholipase C，PLC)是Lm 的主要毒力因子［1］，在细胞代谢、信息传递和抗血小板功能等方面起着重要作用。国内外已将其作为重要生理活性成分及医药原料，广泛应用于药品、化妆品、食品加工等领域［2-4］。PLC 的作用位点为甘油磷脂C3 位酯键，水解生成甘油二酯(DAG)及磷脂酸化合物，如磷酸胆碱、磷酸乙醇胺、磷酸丝氨酸以及磷酸肌醇等(图1)。由于PLC 水解磷脂生成的DAG 是油脂的正常组分，DAG 的变化不仅不会影响精炼油脂的品质，而

且可以提高精炼油得率，近年来日益得到油脂行业的关注，将其应用于油脂酶法脱胶。

图1 磷脂酶C 水解磷脂图Fig.1 Phospholipase C hydrolyze phospholipids PLC 酶法脱胶具有适用性广，反应条件温和，生产中节省酸碱化学品的消耗，几

乎不产生皂脚和废水，经济效益增长明显等一般酶法脱胶的共同优点，但相较于其他的酶法脱胶，如磷脂酶A (Phospholipase A ，PLA)酶法脱胶，PLC 酶法脱胶

不仅能大大缩短脱胶反应时间，还能有效提高毛油得率，降低毛油损耗，通常每500 mg/L 磷就可以提高约1%的油产量［5］，该特点在粮食价格持续上涨的现今社会显得尤为重要。本文通过克隆单增李斯特氏菌plcB 基因，重组表达PLC，并应用该酶对不同的植物毛油进行脱胶研究，具有较大的经济价值和现实意义。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和质粒

单核细胞增多性李斯特菌(L. monocytogenes)CICC No.21540，购自中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC);大肠杆菌(Escherichia coli)JM109、BL21(DE3)、表达载体pET-28a(+)均由本实验室保存;克隆载体pMD18-T simple，购自大连宝生物(TaKaRa)公司。

1.1.2 主要试剂

T4 DNA 连接酶、限制性核酸内切酶NotⅠ、EcoRⅠ，均购自NEB 公司;对硝基磷酸胆碱(p-nitrophehylphosphoryl-choline，简称p-NPPC)、考马斯亮蓝R-250，购自Sigma 公司;蛋白分子质量标准(低)、Ex Taq DNA 聚合酶、DNA Marker DL10000，均购自大连宝生物(TaKaRa)公司;饱和酚、硫酸卡那霉素(Kana)、氨苄青霉素(Amp)、SanPrep 柱式质粒DNA 小量抽提试剂盒、SanPrep 柱式DNA 胶回收试剂盒，San-Prep 柱式PCR 产物纯化试剂盒、丙烯酰胺，N，N’-甲叉双丙烯酰胺(Bis)，购自上海生工生物工程公司;大豆毛油，由中粮提供;菜籽毛油，由湖州新市油厂提供;米糠毛油，由镇江丹阳油厂提供;其他试剂为国产分析纯。

1.1.3 培养基

脑心琼脂培养基:心提取物5 g/L，脑提取物12.5 g/L，蛋白胨10 g/L，葡萄糖2 g/L，NaCl 5 g/L，Na2HPO4 2.5 g/L，琼脂15 g/L，pH 7.4。

LB 液体培养基:蛋白胨10 g/L，NaCl 10 g/L，酵母粉5 g/L，pH 7.4。抗性筛选时加入氨苄青霉素或卡那霉素至终浓度为100 g/mL;LB 固体培养基，添加20 g/L 的琼脂粉。

TB 液体培养基:蛋白胨12 g/L，酵母粉24 g/L，甘油4 mL/L，磷酸盐缓冲液(K2HPO4 12.54 g、KH2PO4 2.31g)100 mL/L。

1.2 L. monocytogenes 基因组DNA 的提取及lmplcB 基因的克隆

L. monocytogenes 基因组的提取参照/氯仿-CTAB法［6］。

根据NCBI 上提供的L. monocytogenes 的plc 基因序列(YP 005964174.1)为模板，去掉信号肽后设计上下游引物:上游引物P1:5’-CGGAATTCATGTGTTGTGATGAATACTTACAAA-3＇(EcoRI);下游引物P2: 5 ’-ATGCGGCCGCTTATTCATTTGTTTTTTT-3＇(NotI)。PCR 反应条件为:94℃，5 min;94℃，30 s，50℃，30 s，72℃，1 min，30 个循环;72℃，10 min，4 ℃保温。

PCR 产物经SanPrep 柱式PCR 产物纯化试剂盒纯化回收后，与pMD18-T simple 连接，连接产物转化大肠杆菌感受态细胞E. coil(JM109)，经Amp-LB 培养基过夜培养筛选阳性克隆，PCR 鉴定后测序，命名为pMD18-T-lm-plcB。1.3 重组表达载体的构建

用限制性内切酶EcoR I 和Not I 对重组载体pMD18T-lm-plcB 和表达载体

pET28a(+)进行双酶切。酶切产物经SanPrep 柱式DNA 胶回收试剂盒纯化后利用T4 DNA 连接酶连接，连接产物转化大肠杆菌感受态细胞E. coli(JM109)，经Kana-LB 培养基筛选，并对阳性菌落进行PCR 和酶切鉴定。

1.4 重组磷脂酶C 的诱导表达

分别将表达质粒pET28a-lm-plcB 和pET28a(+)转化原核表达菌株E. coli

BL21(DE3)，将获得的阳性克隆E. coil BL21(DE3)/pET28a-lm-plcB 接种于