抗体依赖的蛋白生物标志物检测技术进展

综述：抗体依赖的蛋白生物标志物检测技术进展

作者：秦昶博士

生物标志物的概念早在1983年被首次提出，它是指可以标记系统、器官、组织、细胞及亚细胞结构或功能的改变的生化指标，具有非常广泛的用途。由于生物标志物可用于疾病诊断、判断疾病分期或用于评价新药或新疗法在目标人群中的安全性及有效性，展示出在药物研发领域的重要作用。

2010年10月，美国FDA出台文件讨论生物标志物指导原则草案，预示着生物标志物已成为新药临床研究的评价工具之一（图1）。美国NIH给生物标志物以更实用的诠释：用以评价和衡量被试个体生物学过程，病理学过程以及对治疗干预药理学反应的特征指标，包括核酸，蛋白，代谢衍生物在内的诸多分子都可以成为潜在的生物标志物。蛋白是生物学功能的执行者，位于中心法则的功能一端，能够为基础医学、转化医学和精准医学提供最直接的判定依据，因而是研究和应用最为广泛的标志物。因而对蛋白标志物的检测技术也最为重要。迄今为止，抗体仍然是蛋白生物标志物检测最根本的基础，众多方法以抗体为核心建立，并且不断更新和发展，本综述拟从应用视角出发，较为系统地分析和比较现有蛋白生物标志物的检测技术，并结合全新技术的发展，对生物标志物的前景进行展望。

图1. 生物标志物应用的转化医学研究领域

图2. 生物标志物在药物研发领域的应用

蛋白生物标志物可以帮助人们了解生物学过程，能运用于疾病的高危评估，早期诊断，检测定位，预后判断，治疗反应，复发监测全过程。在早期诊断方面，以肿瘤研究为例，生物标志物可以提供预测，诊断和预后信息。特别是近年来兴起的个性化治疗和差异化诊断技术方面，生物标志物发挥的作用也日渐重要。因此不论对于科学研究还是制药企业，生物标志物都是关注的焦点。生物标志物既可以为药物的作用机制，如何影响靶点，以及下游的效应提供关键的洞见（图2），也可在药物早期研究中鉴定药物或治疗手段的毒性和副作用（例如

肝毒性，肾毒性，心脏毒性，肌肉毒性等等。）这对于药物研发有非常重要的意义，据统计，药物研发过程中止的最重要原因来自药物安全性评价或毒理学测试失败（图3，约占33%），而药效不足仅排在第二的位置（26%）。

图3 药物研发失败原因分析

近年来兴起的全新治疗策略，例如嵌合抗原受体T细胞（即CAR-T）治疗急性淋巴细胞白血病也对生物标志物的应用有了新的启示。由于CAR-T细胞本身是具备免疫源性的物质，当输入患者体内时，在治疗效果之外，常会产生非常严重的副反应，例如细胞因子释放综合症（Cytokine Releasing Syndrome, CRS）。人们对于CRS的认识与一位叫做Emily Whitehead的明星患者有很重要的联系。Emily在治疗史上的重要地位在于，在她之前的数位治疗患者，出现过连续的病例死亡的情况，而她本身也发生了严重的炎症反应。幸运的是，治疗团队利用抗炎性药物帮助Emily挺过了让人绝望的高烧。最终Emily成功活了下来。至此，Michel Sadelain（CAR-T技术的命名人，现供职于JUNO公司）等先驱开始应用蛋白多因子检测技术对细胞因子生物标志物在治疗过程中进行监控，并发现治疗后关键的细胞因子CRP表达水平可以很好地判定CRS的风险（图4，参考文献2）。仅当CRP因子的表达量超过20mg/dl 时，才会出现严重的细胞因子释放综合症。来自中国的成功CAR-T治疗案例里，蛋白多因子检测技术也被成功应用（数据未展示）。

图4. CRP标志物监测细胞因子释放综合症

生物标志物检测的创始：免疫组织化学

人类最早是在组织样本中实现了生物标志物的检测。组织特异性的标志物在现代医疗中被经常用来研究肿瘤等疾病中的病理变化。最经典的被转化医学成功应用于组织中标志物检测的方法是免疫组织化学（Immunohistochemistry），特别是在肺炎中的早期应用。免疫组化技术在1940年代发明时（参考文献1），初衷是证实病原体的存在部位，例如肺炎球菌II型和III 型多糖在鼠中的定位。过氧化物酶标记技术在1979年成熟，免疫组化的灵敏度被显著提高。带来的直接益处是福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织切片的免疫组化检测。多数情况下免疫组化使用酶联抗体来进行显色反应，并通过显微镜镜检。尽管在医学检验中使用广泛，但这项技术仍然存在瓶颈：需要非常专业的操作人员和极为严格的标准，还仅能得到半定量的结果。近些年来专家致力于免疫组化的标准化和自动化。但要在全世界各地的实验室实现非常一致的免疫组化，并且在假阳性或假阴性等区分度方面达到一致的判别标准，还面临众多的困难，争论和挑战。人们对免疫组化应用于标志物检测的展望包括提高灵敏度以检测低丰度蛋白，较好的动态检测范围，更高的空间分辨率以判别标志物表达的细胞类型甚至是细胞器类型。另外，免疫组化在多重性，绝对定量以及特异性方面的需求还没有得到有效满足。

生物标志物的应用关键：体液样本检测

生物标志物近年来引起了极大的关注，因为有大量在血浆或血清中的蛋白标志物被鉴定。尽管这些蛋白有较高的转化医学价值，但现有技术的检测灵敏度或检测能力仍然是主要的制约因素。事实上在过去长达15年时间里，平均每年进入临床应用的新的生物标志物仅为1-2个。在平台的选择方面，灵敏度并不是唯一的考量，准确性，可重复性，动态检测范围大小以及样本通量决定标志物检测能力。由此也不难理解为什么质谱技术在体液样本检测中的应用不广：质谱最主要的缺陷是不适合复杂样品的分析，特别是体液样品，体液的样本除了成分复杂，更有巨大的动态范围。

在血清和血浆这样的生物样本中检测蛋白标志物，动态检测范围是区分度的关键。不仅个体间同一指标可以出现几十倍甚至上百倍的产别。同一份样本里的不同标志物更是可以达到10个数量级的差别。例如白蛋白含量大约在30-50mg/mL，而细胞因子可低至pg/mL. 而潜在的大量新型生物标志物甚至会远低于已知标志物的表达水平（新标志物常表达量较低，因而未被传统技术检出）。血清和血浆样本因其容易获得性，一直被当做最理想的生物标志物样本。但由于血液循环系统的稀释作用，血液样本中的蛋白标志物通常含量极低，需要高灵敏度的技术才能有效检测。

总体而言，对于体液样本的检测，人们需要较高的灵敏度来检测表达含量很低的样本。同时，尽可能拥有较宽的动力学范围来适应样本的浓度差异。尽管很多研究者可能认为现有传统技术已经可以很方便地测定一些常规的生物标志物，但事实上人们还是会经常发现有重要的标志物无法测得，并且根据数据结果较轻易相信样本中不存在目标分析物。在意识到现有技术其实不能充分检测样本中含量较低的分析物之前，重要生物学现象的发现机会就已经错失了。关于这一点在后文的篇幅中将做简明扼要的讨论。多重生物标志物检测（Multiplex）技术的兴起和发展使得研究者更容易利用有限的样本和经费做出科研发现，受到广泛的欢迎。但不论哪种平台，多重检测与生俱来的检测指标间相互干扰的问题很难避免，在涉及超高灵