枯草芽孢杆菌的研究进展

枯草芽孢杆菌的研究进展

摘要

枯草芽孢杆菌是一类好氧型、内生抗逆孢子的革兰氏阳性杆状细菌，广泛存在于土壤、湖泊、海洋、动植物的体表，细胞壁不含内毒素，没有致病性，具有单层细胞外膜，能直接将许多蛋白分泌到培养基中，是一些重要工业酶制剂的生产菌[1]。在营养缺乏的条件下，枯草芽孢杆菌停止生长，但同时加快代谢作用，产生多种大分子的水解酶和抗生素，并诱导自身的能动性和趋化性，从而恢复生长。在极端的条件下，还可以诱导产生抗逆性很强的内源孢子，具有较强的抗逆性。作为革兰氏阳性细菌的典型代表，对于其生理、生化、遗传及分子生物学的研究已有40多年的历史。近年来，随着分子生物学和基因工程的发展，枯草芽孢杆菌作为基因工程表达系统发展迅速，并展现出良好的应用前景。

关键词：枯草芽孢杆菌；启动子；绿色荧光蛋白；载体；表达；异源基因

1 枯草芽孢杆菌基因组研究

枯草杆菌有以下一些优点: ①非致病性，不具有热源性脂多糖和细胞内毒素，具有较好的生物安全性，炭疽杆菌和蜡样芽孢杆菌除外，多数芽孢杆菌对人畜无害[2]；②遗传学特性先进，很多噬菌体和质粒适合于用作克隆载体；转化外源DNA的感受态系统也同样适用于转化重组DNA[3]。③较强的蛋白分泌能力，当分泌蛋白跨过细胞膜后，被加工和直接释放到培养基中，使回收和纯化目的蛋白较为简单[4]。④良好的发酵基础和生产技术。枯草杆菌在工业上长期被用于生产蛋白酶、α-淀粉酶以及苏云金杆菌的杀虫晶体蛋白等。枯草杆菌能在相对简单的培养基中能生长到很高的密度。细胞的生长特性和生理学性质都被广泛、深入研究。⑤细胞壁的组成简单，只含有肽聚糖和磷壁质，因此在分泌的蛋白质产品中不会混杂有胞被内毒素（热源性脂多糖），而这一点是大肠杆菌无法比拟的。

2 枯草芽孢杆菌基因表达特性

2.1 多σ因子

原核基因的转录主要由RNA聚合酶完成。该酶由5个亚基组成，二个α亚基、一个β亚基、一个β′亚基和一个Sigma（σ）因子。5个亚基组成全酶，除去σ因子为核心酶（E）。σ因子的主要功能是帮助核心酶识别特定的启动子而结合到转录的起始部位，转录开始后σ因子就不起作用了［5］。

1

2.2 启动子的特征

迄今发现枯草杆菌启动子主要有两种方式：一是单个启动子，具有单个启动子的基因，大多数在快速生长时期表达；另一为复合启动子，它包括串联启动子和重叠启动子。有如下特征：①不同类型的两个启动子重叠；②两个启动子有不同的转录起始位点或相同的起始位点；③启动子可能受时序调节。这类启动子在枯草杆菌感知外界环境的变化、时序调节、孢子形成和萌发等诸多生命现象中发挥重要作用[6]。

2.3 终止子

在大肠杆菌中根据转录终止是否依赖Rho蛋白因子而分为两类，而在芽孢杆菌基因转录的终止方面，只有少数几个基因如spoOA、gnt和trp操纵子等得到很好的研究[7]。它们的终止区都有一个富含GC的对称序列，基因转录是在一串T碱基前终止的。有证据表明，枯草杆菌使用的终止子在结构和序列特征上与大肠杆菌相似。而且也发现大肠杆菌在枯草杆菌中同样起作用。

2.4 芽孢杆菌mRNA的核糖体连接位点(RBS)

与其他原核生物一样，枯草杆菌的RBS也涉及到SD序列、SD序列与起始密码间的间隔区以及起始密码子。芽孢杆菌中最常见的典型序列是“GGAGG”，而大肠杆菌的为“AAGGA”。在芽孢杆菌中，多数基因的起始密码子为AUG，但也发现有些基因中是GUG。目前，尚不十分清楚不同起始密码子的应用对翻译效率有什么影响［8］。

2.5 蛋白的外分泌

大肠杆菌分泌蛋白往往分泌到两层细胞膜之间，而芽孢杆菌只有一层细胞膜，因而可以大量分泌蛋白至培养基中。通过计算机分析，枯草杆菌有将近300个N端具有信号肽用来跨膜的蛋白。不过用来表达和分泌克隆基因的信号肽主要来自蛋白酶、淀粉酶和细胞壁表层蛋白等。

3 枯草芽孢杆菌的重组表达载体

目前报道用作宿主表达克隆基因的有：枯草芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌、淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、球形芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、耐碱的芽孢杆菌、病原菌炭疽芽孢杆菌，以及独立与芽孢杆菌的短短芽孢杆菌［9］。选择不同的芽孢杆菌作宿主，一般都有着极强的应用研究的目的。

3.1质粒载体

在枯草芽孢杆菌中，早期质粒载体主要来自其他革兰氏阳性细菌，特别是来自金黄色葡萄球菌的质粒，其中使用广泛的有Pub110、Pc164、pE194等[10]。它们的主要优点在于分子量小，有唯一的酶切位点，较高的拷贝数，适合筛选的抗性标记。

3. 2 噬菌体

不少噬菌体可用作芽孢杆菌的表达载体，如Φ105噬菌体、sppl噬菌体等，其中Φ105噬菌体应用较多，其基因组约为39.2 kb，利用鸟枪法（shotgun experiment）可方便地分离感兴趣的DNA片段。

3.3染色体整合载体

采用整合质粒将克隆基因整合到宿主染色体，是克服芽孢杆菌质粒不稳定性的一个有效途径。这种质粒的构成包括大肠杆菌质粒复制起点，一个用于选择的抗性标记（如Kan、Em、Cm）以及一两段与枯草芽孢杆菌染色体具有一定同源性的序列，亦称交换臂。

4 枯草芽孢杆菌外源蛋白的分泌表达

4.1 信号肽和信号肽酶

通常，来自枯草杆菌的分泌蛋白能转运到大肠杆菌的周质腔中，而来自大肠杆菌分泌蛋白的信号肽很少能在枯草杆菌中起作用。表明枯草杆菌分泌元件对信号肽结构有特殊要求。

4.2 蛋白质的分泌表达

在枯草杆菌中，由于其α-淀粉酶和一些蛋白酶被大量分泌到培养基中，因此这些酶基因的表达和分泌元件常被用来构建分泌载体。

4.3 蛋白质分泌的机制

近几年，对枯草杆菌蛋白分泌机理的认识取得了较大的进步。许多与分泌有关的元件被鉴定，并发现其中一些成分与大肠杆菌分泌元件有很高的同源性，存在功能上的互补，如枯草杆菌的SecA、SecE 和SecY能分别替代大肠杆菌的SecA、SecE 和SecY行使同样的作用[11]。

4.4 蛋白分泌的影响因素

3