细胞周期

ES与MEF细胞周期对比
J. Biol. Chem. 2005, 280:12976-12987.
ES与MEF细胞周期相关对比
小鼠ES 细胞 中CyclinD表 达很低
Soluble (S) and insoluble (P)
J. Biol. Chem. 2005, 280:12976-12987.
干细胞体外扩增的问题

干细胞的相对静止可以防止它们的未成熟耗竭 (premature exhaustion)，而这正是难于在体外大 量扩增使之用于细胞移植和基因疗法的问题所在。

采用联合使用多种造血细胞生长因子直接扩增后， 依然只有极少数能够为临床所用，而且使用这种 方法，可能会使干细胞的多潜能性和归巢能力下 降。
G2期为有丝分裂准备期

主要是进行蛋白质的合成,包括M期启动所需要的
调节因子和微管蛋白
M期为使染色体等分到两子细胞的过程
细胞在体内的增殖特性
• 持续分裂细胞，又称为周期性细胞，即在细胞周期中连续运 转的细胞。例如需要不断更新的组织中的细胞，包括性细胞、 造血干细胞等。 • 终端分化细胞，即永久性失去分裂能力的细胞，它们不可逆
有细胞达到同步化生长。
• 选择同步法，用物理手段将处于细胞周期中同一阶段的细 胞从非同步的群体中分离开来。常用方法有有丝分裂选择 法、细胞沉降分离法(适用于悬浮培养的细胞，根据不同周 期细胞的体积不同而加以区分）。
细胞周期的调控与诺贝尔奖
• 2001年诺贝尔生理和医学奖颁给了美国科学家Hartwell和 英国科学家Hunt和Nurse。
进入S期 细胞外信号 G蛋白偶联受体 Cyclin E CDK2 RB磷酸化 E2F释放 复合物
Ras-Raf-MEK- Erk 通路 CDK4 Cyclin D CDK6
复合物
cyclin D 的水平决定了细胞周期运转的开始， cyclin E 的水平决定细胞进入S 期。
二、G1—S期

cyclinE与CDK2结合，促进细胞通过G1/S限制点

G1
S G2
过表达Chk2使照射后ES细胞停留在G1期
PNAS, 2004,101(40): 14443–14448
过表达Chk2使照射后ES细胞凋亡率显著下降
PNAS, 2004,101(40): 14443–14448
细胞周期的限制点

小鼠ES细胞的G2期的解连环检验点同样作用不明显。在 成体分化细胞中，细胞只有染色体被拓扑异构酶二解接连
卵裂过程中两种蛋白质的含量随细胞周期剧烈振荡，
在每一轮间期开始合成，G2/M时达到高峰，M结束后
突然消失，下轮间期又重新合成，故命名为周期蛋白
(cyclin)。
常见的由Cyclin
A, B, D,E，分别起着不同的调节作
用。
细胞周期依赖性激酶
一类必须与细胞周期蛋白结合才具有激酶活性
的蛋白激酶，通过磷酸化与细胞周期相关的蛋
G1/S检验点:在酵母中称start点，在哺乳动物中称R
点(restriction point)，控制细胞由静止状态的G1进入 DNA合成期，相关的事件包括：DNA是否损伤？细 胞外环境是否适宜？细胞体积是否足够大？ S期检验点：DNA复制是否完成？ G2/M检验点：是决定细胞一分为二的控制点，相 关的事件包括：DNA是否损伤？细胞体积是否足够 大？ 中-后期检验点（纺锤体组装检验点）：任何一个 着丝点没有正确连接到纺锤体上，都会抑制APC的 活性，引起细胞周期中断。
直是高度磷酸化和失活的。由于RB 的失活，不能与E2F 形
成复合物，从而使E2F 一直处于激活状态并进而导致下游 大量靶基因的激活。

E2F的持续激活解释了小鼠胚胎干细胞培养不需要生长因子 的特性。
细胞周期的限制点

小鼠胚胎干细胞中没有明显的G1/S 检验点： 经过伽玛射线照射诱导DNA损伤之后，大部 分细胞不会停滞在G 1 期，而是直接走向了 凋亡。 这个过程中chk2 (cell cycle checkpoint kinase)分子有重要作用，上调chk2 通过磷 酸化Cdc25A使更多的细胞停留在G1期，同 时抑制细胞凋亡。
G0 期
细胞周期各时相的细胞形态和分子事件
G1期是细胞生长和DNA合成准备期
G1期分为G1早期和G1晚期，两期之间有一个限制
点。

G1期早期的主要内容是细胞生长，有的细胞会长
期停留在此期，即成为G0期细胞。

G1晚期的细胞此时主要的任务是为DNA复制作准
备。
S期为DNA合成期

DNA合成的启动 DNA复制是S期的主要事件 蛋白质合成活跃
在拓扑异构酶二活力被抑制时，ES细胞仍然能够完 成有丝分裂，其Pseudomitotic（假有丝分裂）指数 显著高于MEF细胞
Cancer Cell, 2005,8: 479-484
RA 诱导的分化
向拟胚体的分化
ES细胞的Pseudomitotic指数在分化时显著下降
Cancer Cell, 2005,8: 479-484
细胞周期调控中的重要元素
• • 细胞周期素(cyclin) 细胞周期素依赖激酶
(cyclin-dependent kinase，CDK) • 细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂
（CDK inhibitory protein, CKIs）ຫໍສະໝຸດ 细胞周期蛋白素(cyclin)
1983年Timothy
Hunt首次发现海胆卵受精后，在其
二、干细胞中的细胞周期
1. 胚胎干细胞的细胞周期
2. 成体干细胞细胞周期的调控
胚胎干细胞的细胞周期

胚胎干细胞具有较短的细胞周期，从而能快 速增殖。这种特殊细胞周期主要是由于G1 期的缩短。 在合适的培养条件下，小鼠胚胎干细胞的一 个细胞周期为11 h，G1期只有2 h；人胚胎 干细胞的细胞周期是15-16 h，G1 期只有 2.5-3 h。
CKI对HSC细胞周期的调控
P21
Science, 2000, 287:1804-1808 P27 Nature medicine, 2000,6:1235-1240
是CDK4和CDK6的特异性抑制物。
（二）CIP/KIPs： p21、p27、p57等， 抑制各种cyclin-CDK复合物，阻止CDK激酶的 激活，或阻止活化的CDK激酶活性。
细胞周期的调节过程
一、G1期
细胞在生长因子的刺激下，G1期cyclin D表达，
并与CDK4、CDK6结合，使下游的蛋白质如Rb磷 酸化，磷酸化的Rb释放出转录因子E2F，促进许多 基因的转录，如编码cyclinE、A和CDK1的基因。 G1期是增殖细胞唯一能接受从外界传入的增殖 或抑制增殖信号的时期。
小鼠胚胎干细胞细胞周期运转不可缺少，但是其 分子机制仍然不清楚。
Rb和E2F蛋白

小鼠胚胎干细胞也表达RB蛋白家族(包括RB1/p105、 RB2/p130、RB3/p107)和E2F 蛋白家族，其中，E2F4 是
E2F 家族的主要表达蛋白。

RB1/p105、RB3/p107 在小鼠胚胎干细胞的各个时相中一
白，调控细胞周期。
哺乳动物细胞中，与G1期细胞周期蛋白结合的
CDK激酶主要包括CDK2、CDK4和CDK6。
G2/M期主要受CDK1激酶调控。
CDK Inhibitors (CKIs)
CKIS是CDK抑制蛋白，通过竞争性地抑制cyclin或 cyclin—CDK复合物，导致cyclin生物学功能丧失， 对细胞生长起负调控作用。 G1期CKIS有2个蛋白家族： （一）INKs： p15、p16、p18、p19
长因子即可完成增殖。
胚胎干细胞中的检验点的作用和体细胞
相比作用不是很明显。
三、成体干细胞细胞周期
引言

成体干细胞已经在临床骨髓移植中显示了明确的作
用。最近，关于干细胞可塑性的发现，使人们对应
用成体干细胞发挥广泛的治疗作用抱有了更多希望。

成体干细胞应用的瓶颈是数量稀缺和对增殖刺激表
现出的分化，使它们回输到体内后的效果大打折扣。

这些环节和细胞周期调控密切相关。
干细胞在体内的细胞周期动力学

组织维持成熟细胞数量的恒定，需要有一个能对细 胞因子起反应且增殖能力巨大的祖细胞池和一个数 量少得多的干细胞群，后者间歇的产生子代细胞。

为了防止生理压力下细胞的过早损毁，生物体的一 生需要存在一个相对静止或缓慢分裂的干细胞池。 例如HSC受到严格调控，在机体稳态时以很低的 速率增殖。
Cyclin D与ES细胞周期

转录水平发现cyclin D1 弱表达，cyclin D2 、D3 不表达， Cdk4/cyclin D 激酶的活性未能检测到，因此推测cyclin D
在小鼠ES 细胞 G1/S 转换不起作用。

cyclin D 基因敲除(cyclin D1-/- D2-/-D3-/-)小鼠能够发育到 E17.5 d，最后死于心血管系统障碍，说明在小鼠胚胎干细 胞中，cyclin D 可能不是调控G1/S 转换的惟一分子。
限制点在细胞周期中的作用
Hartwell通过研究酵母菌细胞对放射线的感
受性，提出了check point（细胞周期检验点） 的概念，意指当DNA受到损伤时，细胞周期会 停下来。
细胞周期的运行，是在一系列检验点的严格
检控下进行的，当DNA发生损伤，复制不完全 或纺锤体形成不正常，周期将被阻断。
细胞周期的限制点
调控G1/S转换的信号通路

细胞外激活信号通过G 蛋白偶联受体激活Ras-RafMEK- Erk通路，然后激活cyclin D 的转录，cyclinD 与Cdk4 和Cdk6 形成复合物，催化RB磷酸化使之释 放转录因子E2F，E2F 再激活大量下游分子的转录， 其中包括cyclin E 和cdc25A (cell division cycle25A)。cyclin E 和Cdk2 结合后又可激活自身其 他靶蛋白，并且磷酸化RB ，形成正反馈，最终导致 细胞进入S 期。
环，细胞才能进入M 期，但是胚胎干细胞可以在接连环还
未完成的情况下就可以直接进行有丝分裂。

小鼠胚胎干细胞M 期的纺锤体组装检验点也和体细胞的M 期不同。当阻断微管组装时，细胞并不会走向凋亡，反而 会形成多倍体并可以重新进入新的有丝分裂周期。而且， 这种多倍体细胞可以在一段时间内存在并正常的有丝分裂， 直至最终形成一个相对均一的非整倍体细胞群。
地脱离细胞周期，但保留生理活性机能。如红细胞、神经细
胞、肌细胞等。 • G0细胞，又称为休眠细胞，暂时脱离细胞周期，但在某些 条件诱导下可以重新开始DNA合成，进行细胞分裂，如肝细 胞。
细胞周期的研究方法-同步化
• 诱导同步化，通过控制培养条件，将非同步培养的所有或
大部分细胞暂时性阻止在细胞周期的某个阶段，最终使所
Cyclin E和Cyclin A

Cdk2/cyclin E 和Cdk2/cyclin A 在小鼠胚胎干细胞 的整个细胞周期中都有较高的活性，而cyclin E 的
抑制因子p21cip1、p27kip1 则低表达。cyclin E 被
认为在细胞G1/S 转换过程中起主要作用。

cyclin A过去研究较少，最近报道认为cyclin A 在
阻断ES细胞的微管组装引起多倍体细胞数目的增加
Blood，2007 109: 4518-4527
阻断ES细胞的微管组装引起多倍体细胞数目的增加
Blood，2007 109: 4518-4527
小结
胚胎干细胞具有较短的细胞周期。 胚胎干细胞中RB的失活导致E2F的持续
激活，使小鼠胚胎干细胞培养不需要生
而进入S期。

cyclin A在cyclin E之后很快表达。cyclin A是G1 期向S期转移的限速因素，也可促进细胞从G2 期向M期的转化。
三、在G2-M期
cyclinA、cyclinB与CDK1结合，进而使底物
蛋白磷酸化、如将组蛋白H1磷酸化导致染色
体凝缩，核纤层蛋白磷酸化使核膜解体等下 游细胞周期事件。
第十六课
干细胞中的细胞周期调控 &干细胞可塑性
内容提要
1. 2. 3. 4.
细胞周期简介
ES的细胞周期调控
成体干细胞的细胞周期调控 干细胞可塑性
细胞周期
通常将通过细胞分裂产 生的新细胞的生长开始 到下一次细胞分裂形成 形成子细胞结束为止所 经历的过程称为细胞周 期cell cycle。 正常情况下，一个完整 的细胞周期应该包括四 个时期，细胞按照G1-SG2-M的路线正常运转， 通过M期，母细胞一分为 二。