菠萝中提取菠萝蛋白酶

酶复合物
（二）考马斯亮蓝法测定酶制品中蛋白酶含量
1、标准曲线的制作 按下表操作
管号4 管号 标准蛋白 （0.1mg/ml) 1 2 3 4 5 6 7 8
0
0.1
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
0
待测酶蛋白 磷酸缓冲液 考马斯亮蓝 吸光度A
0 1.0 4 0
0 0.9 4 0.115
0 0.8 4 0.148
0 0.6 4 0.245
0 0.4 4 0.395
0 0.2 4 0.525
0 0 4 0.582
1.0 0 4 0.140 （稀释5倍）
根据上表，以吸光度为纵坐标，标准蛋白质量为横坐标作图
根据线性拟合关系y=6.2357x,计算蛋白酶的质量
（三）菠萝蛋白酶活力的测定
1、取酶制品溶解于0.05mol/L磷酸缓冲液（PH7.0)至10ml, 离心得上清液； 2、取5支试管，分别标号1、2、3、4、5，各加1ml溶液酶 和0.9m激活剂； 3、另取5支试管，分别对应标号 、 、 、 、 ，各加 1ml缓冲液和0.9ml激活剂； 4、将10支试管置于37℃水浴； 5、然后按下表操作
三、实验材料和试剂 1、实验材料 、 新鲜菠萝、0.1mg/ml牛血清蛋白 2、实验试剂 、 维生素c 0.1%EDTA溶液 柠檬酸钠 维生素 单宁 溶液 1.5%氯化钠溶液 1%酪蛋白溶液 1mol/L氢氧化 氯化钠溶液 酪蛋白溶液 氢氧化 钠溶液 0.05mol/L磷酸缓冲液（溶解磷酸二氢钾，加氢氧化钾调 磷酸缓冲液（ 磷酸缓冲液 溶解磷酸二氢钾， PH至7.0） 至 ） 激活剂（ 磷酸缓冲液， 激活剂（PH7.0，0.05mol/L磷酸缓冲液，内含 ， 磷酸缓冲液 内含15mmol/L 硫代硫酸钠和6mmol/LEDTA-2Na,现配现用） 现配现用） 硫代硫酸钠和 现配现用
1 试管号 2 3 4 5
1%酪蛋白
0.2
Fra Baidu bibliotek
0.4
0.6
0.7
0.8
6、按步骤5混匀，在37℃水浴下反应10 min; ℃水浴下反应10 7、向10支试管中各加入8ml1mol/L的氢氧化钠溶液，摇匀， 于室温放置30min; 8、取各自对应的试管在275nm波长下测定吸光度 9、测定结果如下
试管号 吸光度A 1 0.643 2 0.733 3 0.868 4 1.019 5 1.232
由于吸光度在0.2~0.8之间较准确，故上述 数据中可以选择第三组数据进行处理计算
（四）数据的处理 1、由线性关系y=6.2357x，可以计算酶制品中蛋白酶的总质 量m=0.140/6.2357x5=0.1123mg 2、菠萝蛋白酶活力=0.868/10=0.0868U 3、比活力=0.0868U/0.1123mg=0.7729U/mg （五）结果讨论 从上述结果可知菠萝蛋白酶的比活力较低，可能的原因有： 1、所加入的有机酸单宁的量对菠萝蛋白酶沉淀有的影响； 2、在实验中是否把单宁溶液弄混而导致菠萝蛋白酶很少沉 淀析出； 3、菠萝蛋白酶对热不稳定，试验中温度的控制是否合理； 4、在活力测定的步骤中所加入的酪蛋白的量不足，导致结 果偏低；
5、在活力的测定步骤中，设置了几个梯度，最后的结果中 应该有至少两支试管中的溶液的吸光度的值相同，但本组实 验没有得到这种结果。 6、活力测定中，由于操作不当，导致部分沉淀溶解在了上 清液中，溶液微浑浊，对吸光度的测定有影响。
项目一
从菠萝中提取菠萝蛋白酶
微生物09301班第三实验小组 成员：徐雨婷 杨洋 刘杨 何威 刘鄂龙
一、实验目的
1、掌握从原料物中提取分离目的蛋白酶 2、掌握对目的蛋白酶质量的检验 3、学习酶比活力的计算
二、实验基本原理
菠萝蛋白酶是一种具有消炎，抗水肿作用的疏基酶， 能 分解蛋白质、酯和酞胺。 菠萝蛋白酶一般从菠萝汁或菠萝废皮中提取，为浅黄 色无定形粉末，分子量33000，微有异臭，微溶于水，不 溶于乙醇、丙酮、氯仿，乙醚，等电点9.55 。 本实验先从新鲜的菠萝汁中使用有机酸（单宁）沉淀 法提取出菠萝蛋白酶，然后通过考马斯亮蓝法测定酶制品 中菠萝蛋白酶的总量，最后菠萝蛋白酶将酪蛋白水解产生 酪氨酸，通过在275nm波长下测定吸光度的变化，可以测 得菠萝蛋白酶的活力。
四、实验器材和仪器
1、榨汁机； 2、离心机； 3、紫外可见分光光度计（2cm石英比色皿）； 4、恒温水浴锅（37℃）； 5、试管、试管架； 6、烧杯、容量瓶； 7、移液管；
五、实验操作方法法和步骤 实验操作方法法和步
（一）从菠萝中提取菠萝蛋白酶 操作步骤： 将菠萝切碎
加柠檬酸钠，榨汁 冻存备用
菠萝汁
纱布过滤 酶复合物沉淀 离 心 钠 加 溶 液 量 ， 1.5% 氯 化 适 4000r/min,7min
澄清液
2000r/min，7min离心 加Vc,0.2%单宁溶液 搅拌15min,静置40min 4200r/min,5min离心
上清液 沉淀物
加100ml0.1%EDTA溶液， 200ml1.5%氯化钠液 4200r/min,5min离心