基因工程原理第123章讲义详解

基因工程原理

第一章绪论（基因与基因工程概论）

第一节基因概念的发展

1．基因学说

基因工程或称基因操作，是在分子生物学和分子遗传学等学科综合发展的基础上、于本世纪70年代诞生的一门崭新的生物技术学科。它的创立与发展，直接地依赖于基因分子生物学的进步，两者之间有密切而不可分割的内在联系。

根据不同历史时期的水平和特点，基因研究大体上可分为三个不同的发展阶段：在上个世纪50年代以前，主要是细胞染色体水平上进行研究，属于基因的染色体遗传学阶段；50年代之后，则主要从DNA 大分子水平上进行研究，属于基因的分子生物学阶段；最近30多年，由于重组DNA技术的完善和应用，人们已经改变了从表型到基因型的传统研究基因的途径，而能够直接从克隆目的基因出发，研究基因的功能及其表型间的关系，使基因的研究进入反向生物学阶段。

基因最初是遗传学概念，随着生物学科的不断发展及生命科学理论与技术研究的不断深入与完善，人们对基因本质的认识及其定义也在不断深化。很多先驱科学家及其开创性的科学研究为基因研究的发展建立了功不可没的丰功伟绩。

1866年，奥地利遗传学家G. Mendel(孟德尔)根据豌豆杂交试验，首次提示了遗传学的基本规律，如分离定律和自由组合定律。阐明了遗传不是性状本身，而是决定性状的遗传因子。

1909年，丹麦生物学家W. Johannsen根据希腊文“给予生命”之义，创造了基因(gene)一词，这一术语却一直沿用至今，并发展为决定遗传性状的物质基础。

1910年，美国著名遗传学家T.H. Morgan(摩尔根)和他的助手们以国蝇为材料，确认遗传物质的基础存在于染色体中并提出基因连锁和互换定律。第一次将代表某一特定性状的基因同某一特定的染色体联系起来，创立了遗传的染色体理论。

2．DNA是遗传信息的载体

1928年，F. Griffith首先发现了肺炎双球菌的转化现象。转化因子是什么？1944年，美国著名微生物学家O.T. Avery与他的合作者们重复了Griffith的转化实验，并进一步对无毒细菌变成有毒细菌的转化物质进行了分离和化学上的鉴定，证明使细菌性状发生转化的因子是DNA而不是蛋白质或RNA分子。Avery 等人的工作在遗传学理论上树起了全新的观点，即DNA分子是遗传信息的载体。

1952年，美国冷泉港卡内基遗传学实验室的科学家A.D. Hershey和他的学生用他们的噬菌体感染实验进一步肯定了Avery的结论。他们用放射性同位素35S和32P分别标记噬菌体的外壳蛋白质和核心DNA，用双标记的噬菌体感染大肠杆菌，结果表明噬菌体的蛋白外壳没有进入细菌体内，只有DNA进入到了细菌细胞中，进一步证实了遗传物质是DNA，而不是蛋白质。

证明了DNA是遗传物质和基因的载体之后，遗传学家和分子生物学家进而着手研究维系生命现象的基础——DNA分子的自我复制的过程，以揭示遗传信息是如何从亲代准确地传递到子代的本质。1953年，J. Watson和F. Crick的DNA双螺旋结构模型成为解密DNA分子的复制过程的钥匙，特别是DNA半保留复制规律的揭示使遗传学家长期感到困惑的基因自我复制问题得到了最后的解决，也为基因存在于DNA，遗传信息可以通过DNA的半保留复制而传代下去的认识提供了基础。

至此，基因以一种真正的分子物质呈现在人们面前，科学家能够像研究其它大分子一样，客观地探索基因的结构及功能，从分子层次上研究基因的遗传现象，进入了基因的分子生物学新时代。

基因在DNA顺序上的多样性：（1）基因的不连续性；（2）基因的重叠性；（3）重复序列(repeated sequence)。

3．基因及其产物

最初基因的功能是如何同蛋白质联系在一起的呢？早在1902年，A. Garrod在研究人类黑尿病(alkaptonurea)时指出：这种病是由于缺乏某种酶催化代谢反应所致。这是最早把基因的功能同蛋白质的作

用联系在一起。但是，第一次明确提出“一个基因一种酶”假说的学者则是G.W. Beadle和E.L. Tatum。直到1957年，英国剑桥的科学家V.M. Ingram对镰形细胞贫血症(sickle cell anemia)的血红蛋白和正常的血红蛋白的氨基酸序列作了对比研究，才第一次用实验证实了基因同蛋白质之间的直接联系。

1958年，F. Crick在综合分析了50年代末期关于遗传信息流向的各种研究结果的基础上，提出了描述DNA、RNA和蛋白质三者关系的中心法则(central dogma)。1970年，H.M. Temin和D. Baltimore发现一些RNA病毒在寄主细胞中的复制过程是先以病毒的RNA分子为模板，在反转录酶的作用下合成DNA互补链，然后以DNA链为模板合成新的病毒RNA。这说明遗传信息可以从RNA反向传递到DNA。为此，1971年，F. Crick修改了中心法则。

当我们思考转录和转译这两个过程时会发现，转译和转录不同，它不是简单的核苷酸顺序的抄写，而是将RNA分子上的核苷酸语言翻译成蛋白质分子上的氨基酸语言的复杂过程，是涉及到两种不同语言信号之间的更换问题。在转译过程中，必定存在着一种特殊的遗传密码系统，才可以将RNA分子上的核苷酸顺序，同蛋白质分子上的氨基酸顺序联系起来。在50年代末和60年代初，关于遗传密码的研究是基因分子生物学中最活跃的课题。

到1961年底，有关遗传密码的若干主要问题都得到了解决。第一个问题是密码比，证实是由3个碱基编码一种氨基酸，我们称这种碱基三联体为密码子。第二个问题是密码是否重叠，结论是不重叠。第三个问题是相邻的2个三联体之间是否存在着“逗号”之类的分割符，碱基的缺失和增加突变研究表明，这种想法不符合事实。

在解决了上述问题之后，剩下的就是要设法弄清每一种氨基酸到底是由哪一种三联密码子编码的。至1966年，所有64种密码子便全部破译出来了。除了线粒体和叶绿体存在的个别特例外，所有生物，包括病毒、原核的和真核的，它们的密码子同氨基酸之间的关系都是同样的，因此说遗传密码是通用的。遗传密码的通用性是我们赖以开展基因工程的最重要的理论基础之一。

第二节基因工程

1．基因工程的诞生

人们公认基因工程诞生于1973年。

从40年代到70年代初基因工程的诞生，其中现代分子生物学领域理论上的三大发现及技术上的三大发明起了决定性的作用。

（1）理论上的三大发现

第一，40年代确定了遗传信息的携带者，即基因的分子载体是DNA而不是蛋白质，从而明确了遗传的物质基础问题。

第二，在50年代揭示了DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制机理，解决了基因的自我复制和传递问题。

第三，在50年代末期和60年代，相继提出了“中心法则”和操纵子学说，并成功地破译了遗传密码，从而阐明了遗传信息的流向和表达问题。

（2）技术上的三大发明

第一，DNA分子的体外切割与连接技术是基因工程诞生的第一个技术发明。应用核酸内切限制酶和DNA连接酶对DNA分子进行体外是切割和连接，这是在60年代末期和70年代初期发展起来的一项重要的基因操作技术，有人甚至说它是重组DNA的核心技术。

1970年，H.O. Smith和K.W. Wilcox, T.J. Kelley从流感嗜血杆菌中分离并纯化了限制性核酸内切酶Hind II，使DNA分子的切割成为可能。1972年，H. Boyer实验室发现了核酸内切酶Eco R I，识别GAATTC序列，切割DNA分子后形成具有粘性末端的片段，具有相同粘性末端的任何不同来源的DNA片段，都可以通过末端之间的碱基互补作用而彼此“粘合”起来。以后，又相继发现了大量类似于Eco R I这样的核酸内切酶，这就使研究者可以获得所需的DNA特殊片段，为基因工程提供了技术基础。

对基因工程技术突破的另一发现是DNA连接酶。1967年，世界上有5个实验室几乎同时发现了DNA