高免卵黄抗体提纯及提取液冻干的研究

作者简介胡晓苗（１９７１－），男，安徽望江人，在读硕士，助理研究员，从

事兽医研究。

收稿日期

２００６!０４!１３

由于高免卵黄抗体自身的一些缺陷，近年来在全国大部分地区禁止使用高免卵黄抗体。其缺陷是：①卵黄抗体往往由商品蛋所制作，带由鸡霉形体、

禽白血病、鸡白痢、鸡传贫、沙门氏菌等多种病原体，这些病原体可经卵黄液的使用而垂直传播，从而引起相应的疾病。即使卵黄液中加入一定的防腐剂和抗生素，但对病毒无效［１，２］。另外，蛋黄中含有大量分子量很大的卵黄磷蛋白及脂肪等物质，注入肌肉难以吸收而造成局部肿胀、坏死、过敏反应［２］。②常规卵黄抗体经稀释分装而成，体积大，运输不便。另外，需低温保存和运输，由于反复冻融和运输不当而造成效价降低。因此，笔者进行了卵黄体抗体的提纯和提纯液的冻干研究，旨在克服卵黄抗体的缺陷。

１卵黄抗体的提纯１．１

材料与方法

１．１．１材料。聚乙二醇（ＰＥＧ６０００，进口分装，购自合肥大药

房）；高免鸡蛋（测其效价为１∶１２８）；法氏囊标准抗原及阳性血清（购自哈兽研）；琼脂糖粉（浙江某生物化工厂）。

１．１．２方法。

（１）提纯用高免卵黄液的制备。

将收集的高免蛋浸泡消毒，无菌分离蛋黄，经无菌搅碎机搅拌５ｍｉｎ，按１∶１加入无菌生理盐水，用双层无菌纱布过滤，加入青霉素、链霉素各１０００单位、

叠氮钠至０．０１％浓度，置４℃冰箱备用。（２）１％琼脂糖平板：称取琼脂糖１ｇ，溶于１００ｍｌ生理盐水中，加热融化，然后乘热倒入平皿中，冷却后放入冰箱备用。

（３）ＰＢＳ缓冲液［３］。ＫＨ２ＰＯ４１３．６ｇ、ＮａＣｌ５８．４ｇ、ＮａＣＮ３１．０ｇ，用９８００ｍｌ蒸馏水溶解，装入１万ｍｌ血清瓶，用１ｍｏｌ／ＬＮａＯＨ调至ｐＨ值７．５（大约用１００ｍｌ），定容至刻度处，高压灭菌后备用。

（４）卵黄液中免疫球蛋白ＩｇＧ的提取［４］。在高免卵黄液中加入４倍体积的ＰＢＳ缓冲液，充分摇匀，再加入ＰＥＧ

６０００，使其最终浓度达４％，搅拌１０ｍｉｎ后，４０００ｒ／ｍｉｎ离

心３０ｍｉｎ。无菌收集上清液再加入ＰＥＧ６０００，使其最终浓度为１２％，搅拌１０ｍｉｎ，同上离心，弃上清液，所得产品即为粗提的ＩｇＧ。

１．２结果与分析１．２．１ＩｇＧ效价。琼脂扩散法：将提纯的抗体稀释致原卵黄

液体积，用事先准备的琼脂糖平板，放在事先画好的７孔图案上，打孔，加入标准抗原和ＩｇＧ稀释液。将平板放在湿盒中，置３７℃温箱中２４～４８ｈ观察，结果为平均效价１２８。说明用此法提取ＩｇＧ时能充分提取，即效价不变。

１．２．２ＩｇＧ稀释液检验。

（１）细菌学检验。将ＩｇＧ稀释液接种于营养琼脂试管斜面上，３７℃鸡胚培养２４ｈ，观察到无细菌生长。

（２）病毒学检验。将９日龄ＳＰＦ鸡胚（购自山东家禽研究所）１０枚，分为２组，ＩｇＧ稀释液接种１组，０．２ｍｌ／枚；另一组作对照，接种生理盐水，３７℃鸡胚孵化５ｄ后通过照蛋，可以看出血管清晰，说明２组鸡胚均生长良好。将鸡胚放入４℃冰箱过夜，第２天观察鸡胚，２组均未发现病变。通过检验说明，用提纯卵黄抗体的方法，避免了细菌和病毒的垂直传播，而且排除了卵膦子等大分子物质的应激反应。

２卵黄抗体提取液的冻干

液体状的卵黄抗体在保存和运输上存在着体积大易失

活等缺点，而冷冻干燥技术能使纯化的抗体在预先冷冻的状态下，不经液态直接升华除去水分而获得干粉型制剂，它避免了液态下保存的抗体易失活易变形的缺点，使产品体积大大缩小，便于运输及能够长时间保存［５］。

２．１材料和方法

２．１．１材料。ＩｇＧ稀释液，冷冻真空干燥机（安徽省农科院畜牧兽医研究所兽药制剂室），蔗糖，真空枪。

２．１．２

方法。在ＩｇＧ稀释液中加入浓度５％蔗糖作为冻干

干燥剂，经定量分装机分装２ｍｌ于７ｍｌ西林瓶内，放入冷冻真空干燥机中制成冻干制剂。用真空枪检验，如果呈现蓝色荧光，表明瓶内处于真空保存状态，为合格产品。

２．２结果与分析

２．２．１

安全性检验。取３０日龄健康鸡（河南故始三高集团

提供）２０只，分为２组，一组肌注冻干稀释液（１∶４倍稀释，即每瓶加生理盐水８ｍｌ，稀释后效价为１∶３２）２ｍｌ，另一组肌注

４ｍｌ，观察１０ｄ。结果２组精神状态一直良好，临床未见异

常表现，剖检未见病变，说明ＩｇＧ冻干制剂使用安全。

２．２．２抗体冻干前后的效价测定。琼脂扩散法测定效价变

化情况：抽查２个批组，每批随机抽取１０瓶，测定结果都为

１∶１２８，说明制成冻干制剂对效价无影响。２．２．３

温度对抗体效价的影响。将常规未提纯卵黄抗体液

和ＩｇＧ冻干制剂于不同温度下作用一定时间后，用琼脂扩

散法测定效价变化情况，结果见表１。

（下转第２１５０页）

高免卵黄抗体提纯及提取液冻干的研究

胡晓苗１，２，李春芬２，汪丽１，赵磊２

（１．安徽省农业科学院畜牧兽医研究所，安徽合肥２３００３１；２．安徽农业大学动物科技学院，安徽

合肥２３００３６）

摘要针对高免卵黄抗体的缺陷，采用聚乙二醇法提纯卵黄抗体ＩｇＧ，ＩｇＧ稀释为原卵黄液体积时效价不变，为１∶１２８，细菌和病毒学检验均为阴性。将ＩｇＧ稀释液制成冻干制剂，实验表明冻干后效价不变且对温度的抵抗力大大提高，冻干制剂防治效果良好。说明此

种方法可避免常规卵黄抗体临床传播疫病的危险，运输和保存更加方便，真正做到了安全、

高效。关键词卵黄抗体；提纯；ＩｇＧ；冻干；琼脂扩散法中图分类号Ｑ９５９．９文献标识码Ａ文章编号０５１７－６６１１（２００６）１０－２１４７－０１

安徽农业科学，ＪｏｕｒｎａｌｏｆＡｎｈｕｉＡｇｒｉ．Ｓｃｉ．２００６，３４（１０）：２１４７，２１５０责任编辑曹淑华责任校对曹淑华