图位克隆技术在分离植物基因中的应用

收稿日期:1999-06-15;修回日期:2000-01-13基金项目:国家自然科学基金资助项目(39770455)

作者简介:景润春(1971-),男,在读博士研究生,现从事植物发育遗传学研究。

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图位克隆技术的原理及基本技术环节

现在,分离和克隆发育相关基因的方法有很多,如传统的功能克隆(functional cloning),即根据纯化的已知基因的产物推算其相应的核苷酸序列,再据此序列合成寡聚核苷酸探针从cDNA 文库或基因组文库中钓取目的基因。另外,还有近年来发展十分迅速的表型克隆(p honet yp ical clonin g )

112

,例如

差别筛选法(differential screenin g )122、扣除杂交技术(subtractive h y bridization)132、mRNA 差异显示技术(mRNA differential dis p la y reverse transcription -PCR,DDRT -PCR)

142

、代表性差示分析

(representational difference analysis,RAD)152

、抑制性扣除杂交

(suppression subtractive hybridization,SSH)162等。表型克隆技术都普遍存在着依赖于PCR 技术、重复性较差、假阳性率高、对实验材料要求较高、材料间不能存在过多的差异、结果不便确证等缺点。而且,大多数情况下,我们并不知道基因的表达产物,在未知基因的功能信息又无适宜的相对表型用于表型克隆时,最常用的基因克隆技术有图位克隆(map -based gene

clonin g 或p ositional clonin g )172和转座子标签(trans p oson ta g -g in g )182

技术。转座子标签技术是利用转座子从一个基因座转到另一个基因座引起的插入突变,使插入位置的功能基因失活并诱导产生突变型,从而可以检测突变基因的位置并分离该基因。利用转座子标签技术对尚未发现转座子的植物进行基因克隆时,需要将异源的转座子导入该植物,但由于转座子在不同的植物中转座的频率和活性相差很大,并且需要筛选大量的个体来鉴定转座子突变个体,植物基因组中多拷贝基因的存在还会限制转座子标签技术的应用,因而转座子标签技术的应用范围是十分有限的192

。

图位克隆技术是近几年随着各种植物的分子标记图谱的相继建立而发展起来的一种新的基因克隆技术,是根据功能基因在基因组中都有相对较稳定的基因座,在利用分子标记技术对目的基因进行精细定位的基础上,用与目的基因紧密连锁的分子标记筛选DNA 文库(包括YAC 、B AC 、TAC PAC 或Cosmid 文库),从而构建目的基因区域的物理图谱,再利用此物理图谱通过染色体步查(chromosome walking)逐步逼

图位克隆技术在分离植物基因中的应用

景润春,黄青阳,朱英国

(武汉大学发育生物学研究中心武汉大学遗传研究所,武汉430072)

摘要:本文综述图位克隆技术的原理及基本技术环节,并与其它基因克隆技术相比较说明图位克隆技术的优缺

点。本文还对近年来图位克隆技术在分离不同的植物发育基因上的广泛应用进行了简要概述,并对其应用前景和近期的预期进展作出展望。

关键词:图位克隆;基因定位;物理图谱;比较作图中图分类号:Q943.2

文献标识码:A

文章编号:0253-9772(2000)03-0180-06

The A pp lication of Ma p -based Gene Clonin g

Method on Isolatin g Genes of Plants

JI NG Run -chun,HUANG Qin g -y an g ,ZHU Yin g -g uo

(Cen ter of Devel opmental Biology an d In st itu te of Genetics,W uh an Un iversit y ,W uh an 430072,Chin a )

Abstract:I n this review,the principle and basis steps of map -based gene cloning on plant were introduced in de -tail.At the same time,the advantages and disadvantage of the method w ere evaluated as compared with the other

methods.The extensive application of the map -based gene cloning method on cloning genes of different plants in the p ast was also summ arized in brief.The p ros p ect and the ex p ected p ro g ress in several y ears were p ro p osed in this p a p er.

Ke y words:m a p -based g ene clonin g ;g ene ma pp in g ;p h y sical ma p ;com p rative ma pp in g 综述

遗传HEREDITAS (Beijing)22(3):180~1852000

181 3期

近目的基因或通过染色体登陆(chromosome landing)1102的方法最终找到包含该目的基因的克隆,并通过遗传转化试验证实目的基因的功能。而且,随着各种植物的高密度遗传图谱和物理图谱的相继构建成功,图位克隆技术在植物的基因克隆中有着更广阔的应用前景。图位克隆技术主要包括4个基本技术环节:目的基因的初步定位;精细定位;构建目的基因区域的物理图谱和精细物理图谱直至鉴定出包含目的基因的一个较小的基因组片段;筛选cDNA文库并通过遗传转化试验证实所获目的基因的功能和序列分析。

目的基因的初步定位(ma pp in g the tar g et g ene)是利用分子标记技术在一个目标性状的分离群体中把目的基因定位于染色体的一定区域内。分子标记是在DNA双螺旋结构理论的基础上建立起来的一类DNA分子水平的遗传标记技术,常用的有限制性片段长度多态性(restriction fragment length poly-morphism,RFLP)1112、RAPD标记(random amplified polymorphic DNA,RAPD)1122、微卫星标记(microsatellite DNA)1132、AFLP标记(am p lified fra g ment len g th p ol y mor p hism,AFLP)1142。利用这些高效分子标记技术结合使用近等基因系1152或集团分离分析1162就可以快速地把目的基因定位于基因组中某染色体的一定区段上。在初步定位的基础上,接下来就要利用高密度的分子标记连锁图对目的基因区域进行区域高密度分子标记连锁分析以便精细定位(fine ma pp in g或hi g h-resolution ma p-p in g)目的基因。虽然以PCR为基础的分子标记的使用使分析较大群体成为可能,但是,精细定位目的基因仍然是图位克隆策略中最艰苦和最耗时的限速步骤1112。利用侧翼分子标记分析1172和混合样品作图1182可以有效地提高精细定位的效率。侧翼分子标记分析是利用初步定位的目的基因两侧的分子标记来鉴定更大分离群体单株以确定标记与目的基因间发生交换的单株,再用这些单株分析两个标记间的所有分子标记以确定与目的基因连锁最紧密的分子标记。利用侧翼分子标记分析已成功地把番茄的叶霉病基因Cf-2精细定位到40kb的区间1172。混合样品作图是在准确鉴定目的基因的表型的基础上,把大群体中的单株分别混合提取DNA并且用目的基因附近的所有分子标记对混合的DNA样品池进行分析,根据所有池中包含有交换的DNA池的比例来确定与目的基因连锁最紧密的分子标记和目的基因附近所有分子标记的顺序。混合样品作图可以极大地提高分子标记分析效率,减小DNA提取的工作量,有利于扩大群体。

在精细定位目的基因的基础上,就要确定目的基因区域的近似的物理距离和遗传距离的比值(kb/cM),这就要构建目的基因区域的物理图谱(p h y sical ma p)。物理图谱的实质是基因组克隆和DNA片段的染色体顺序排列。物理图谱可以直接为基因座提供DNA片段,还可以为DNA序列分析提供底物。大尺度物理图谱的构建依赖于稀有位点内切酶的发现和脉冲凝胶电泳技术的确立。大尺度物理图谱的构建目前主要用限制性核酸内切酶图谱分析 以PCR为基础的包括STS 在内的分子标记分析和整个克隆间杂交等方法进行。大尺度物理图谱(YAC、B AC等)的建立可以有效地确定分子标记间的真实的物理距离和证实目的基因区域的分子标记顺序。精细物理图谱(Cosmid、K等)为构建目的区域的饱和分子标记连锁图和减少筛选鉴定候选基因的工作量打下基础。当距离目的基因最近的分子标记与目的基因间具有非克隆区段或重复序列时,就要采用染色体跳跃策略(chromosome j um p in g)来逼近目的基因。筛选和鉴定侯选基因克隆是图位克隆策略中最后的环节,一般而言每100kb的基因片段中要包含有上十个的基因,从cDNA文库中筛选这些基因和从这些侯选基因中鉴定出真正的目的基因也绝非易事。近年来,分离基因组大片段DNA编码的cDNA的技术在不断地创新发展。值得注意的是/外显子捕捉01192和/cDNA直接筛选01202技术。/外显子捕捉0是应用RNA剪接因子的识别功能来识别克隆于载体中的基因组DNA片段,载体本身包含有完成剪接事件所必需的剪接信号,如果插入载体中的基因组DNA片段包含有外显子序列和与剪接信号互补的序列,整个剪接事件就可以完成。/cDNA直接筛选0是一种获得区域特异的cDNA克隆的方法,先将YAC BAC Cos质粒固定起来,然与目的基因高丰度表达的cDNA文库杂交,洗除非特异性吸附后再洗脱下特异性杂交的cDNA,并用PCR方法扩增后克隆。由于鉴定的覆盖目的基因区域的大片段基因组DNA中可能包含有多个基因或者由于筛选技术本身的假阳性,所以在用覆盖目的基因区域的大片段基因组DNA克隆筛选区域特异的cDNA后仍需对目的基因编码的cDNA作进一步证实。现有几种方法来证实目的基因编码的cDNA克隆:¥精细作图来证实某候选基因克隆与目标性状共分离;¦证实某候选基因克隆的时空表达模式与目标性状的表现相同;§把候选基因序列与现有已知功能基因序列数据库进行同源性比较,推断其功能;¨比较候选基因序列在野生型与突变型之间的差异,确定在野生型与突变型之间变异的cDNA序列;©转化候选基因,进行遗传互补实验,这是最直接的证明1102。随着图位克隆技术的发展,把目前的各种方法综合使用已成为一大趋势,把染色体步查技术(chromosome walking)和染色体登陆技术(chromosome landin g)有机结合,把物理图谱的构建和精细定位目的基因相统一,并且迅速地吸收利用当前出现的象DNA 芯片(DNA chi p)1212这样的先进技术,对图位克隆技术在植物基因克隆中更好地应用也是十分有益的。

2应用图位克隆技术成功克隆的植物基因

自1992年图位克隆技术首先应用在拟南芥(Arabido p sis thaliana)上成功分离ABI31222基因和FAD31232基因以来,已有二十多个植物基因用此技术成功克隆(见表1)。由于抗性基因的遗传行为比较简单而且抗性性状表型也比较容易鉴定,所以克隆的这些基因主要是对病原(真菌、细菌、病毒和寄生虫)的抗性基因(resistance g ene,R g ene)。可以说,目前R基因的分离和克隆基本上代表了图位克隆技术在植物未知产物功能基因克隆上应用的最新进展1242。所有这些抗性基因的分

景润春等:图位克隆技术在分离植物基因中的应用