丁基苯酞对低糖低氧引起神经细胞内钙升高的作用

丁基苯酞对低糖低氧引起神经细胞内钙升高的作用
熊　杰,冯亦璞3
(中国医学科学院,中国协和医科大学药物研究所,北京100050)
摘要　目的:探讨抗脑缺血新药丁基苯酞(NBP)对脑缺血过程中细胞内游离钙升高的影响及其作用机制。

方法:采用低糖低氧损伤胎鼠或新生鼠神经细胞以模拟脑缺血,用Fura22/AM作荧光指示剂,观察手性丁基苯酞对神经细胞内游离钙升高的抑制作用,并用内钙释放剂thapsigargin,外源性谷氨酸,高K+及钙离子载体A23187作工具药,对其作用环节进行分析。

结果:d2,l2,dl2丁基苯酞能完全抑制低糖低氧造成的神经细胞内钙升高。

手性NBP 能降低thapsigargin引起的内质网钙库释放,d2NBP还对谷氨酸引起的内钙升高表现出抑制作用。

结论:丁基苯酞抑制低糖低氧条件下神经细胞内钙升高的作用环节主要是抑制细胞内钙库的释放。

关键词　丁基苯酞;低糖低氧;细胞内钙;钙离子荧光指示剂(Fura22/AM)
丁基苯酞(dl232n2butylphthalide,dl2NBP)是我所研制的抗脑缺血一类新药,药效学研究表明有良好的抗脑缺血活性[1～5]。

以往在大鼠尾动脉环实验中曾发现dl2NBP能抑制去甲肾上腺素引起的细胞[Ca2+]i升高作用,而对外钙入胞无影响[6],同时大量实验还提示NBP对脑缺血时细胞内钙升高可能有抑制作用[7]。

为此,我们用Fura22/AM作为荧光指示剂[8],采用双波长荧光分光光度法,观察了低糖,低氧或低糖低氧处理对大鼠胎鼠神经细胞[Ca2+]i水平的影响及手性丁基苯酞(d2,l2NBP)和消旋丁基苯酞(dl2NBP)的作用;并用内钙释放剂Thapsigargin,外源性谷氨酸,高K+以及钙离子载体A23187作工具药,分析了NBP对[Ca2+]i影响的可能作用机制。

材料与方法
动物　清洁级Wistar孕鼠,孕期16～18d,购于中国医学科学院实验动物繁殖中心。

药品与试剂　d2,l2和dl2NBP,由本所合成室杨靖华教授提供,黄色油状液体,纯度>96%。

先溶于少量DMSO中,再加入4倍体积双蒸水,制成10-2mol・L-1的混悬液,再以双蒸水依次稀释至
收稿日期:1999204226
基金项目:国家科委1035工程重大项目基金(942ZD201)和国家自然科学基金重大项目基金资助项目(29790122) 3联系人　Tel:(010)63165173,Fax:(010)63017757,
E2mail:fengpy@ 10-3,10-4和10-5mol・L-1。

Fura22/AM,本所合成室提供,溶于DMSO成1mmol・L-1溶液,-20℃分装保存。

EGTA[ethylenegly colbis2(22aminoe2 thyl2ether)tetracetic acid]购于北京化学试剂公司,溶于3mol・L-1Tris中,成015mol・L-1溶液。

BSA 和M K2801,购于Sigma公司;Triton X2100,购于香港FARCO化学公司;谷氨酸,购于Serva公司,均溶于019%生理盐水。

Thapsigargin,购于Sigma公司,完全溶解于DMSO成3mmol・L-1溶液,-20℃分装保存,使用时以DMSO稀释。

小于3μmol・L-1的稀释液只可一次性使用[12]。

A23187,购于Sigma 公司,溶于DMSO。

高糖(含D2葡萄糖415g・L-1)和低糖(含D2葡萄糖110g・L-1)DM EM培养基,购于GIBCO BRL公司。

Hanks液(mmol・L-1): NaCl137,KCl5,CaCl2113,MgSO4・7H2O018, Na2HPO4・H2O016,KH2PO4014,NaHCO3310, G lucose516,p H712。

仪器　F24010双波长荧光分光光度计,日本Hitachi公司。

方法　Wistar孕鼠以10%水合氯醛(360 mg・kg-1,ip)麻醉后,取出胎鼠7～8只。

将完整大脑半球置高糖DM EM中制成细胞悬液,经200目细胞筛过滤3次,经1000r・min-1离心5min,去上清液,正常对照组细胞悬浮于高糖DM EM中,低糖低氧组悬于Ar2饱和的低糖DM EM中,并以封口膜密闭。

细胞数均在5×106个・mL-1,给药组同时加入药物,置37℃,含5%CO2环境中处理。

处理后的样本经1000r・min-1离心5min,倾去上清液,所得
细胞重新悬浮于等体积Hanks液中,常规进行负载,清洗和细胞荧光测定。

观察药物作用时,神经细胞直接悬浮于Hanks 液中,进行负载和荧光测定。

测定前对样品和DMSO均进行扫描,以消除药品和溶剂自身的荧光干扰。

d2,l2或dl2NBP在工具药加入前2min加入样品池。

测定条件　Ex WL1340nm,Ex WL2380nm, Em WL500nm,Ex bandpass5nm,Em bandpass10nm,测定温度37℃。

数据处理　所测得各数据均减去细胞自发荧光值,给药组数据均减去细胞和药物自发荧光值,再代入Grynkiewicz公式[8][Ca2+]i=Kd(R-Rmin)/ (Rmax-R)×(Sf2/Sb2),计算细胞内游离钙浓度。

全部数据均采用t检验进行统计学处理。

结果
1　低糖低氧损伤条件的确立
由表1可见,正常胎大鼠神经细胞[Ca2+]i水平较低,为142137±21153nmol・L-1;单纯低氧或单纯低糖处理细胞1h,并不影响[Ca2+]i水平;而低糖合并低氧处理细胞1h,则[Ca2+]i明显升高。

T ab1　Changes in[C a2+]i level in rat fetal neurons subjected to hypoxia,hypoglycemia or hypoxia/ hypoglycemia compared with normal group.H ypo: hypoxia/hypoglycemia
Group[Ca2+]i/nmol・L-1
Normal 142.37±21.53
Hypoxia-1h167.23±23.31
Hypoglycemia-1h140.42±27.17
Hypo.-0.5h249.02±51.9833
Hypo.-1h262.02±21.6133
Hypo.-3h538.04±74.4233
x±s,n=4.33P<0101vs normal.
由低糖低氧处理引起神经细胞内钙升高的时间曲线表明,胎大鼠神经细胞[Ca2+]i水平随低糖低氧时间的延长而持续升高。

当处理时间分别为015 h(Hyp.-015h),1h和3h时,细胞[Ca2+]i水平分别达到249102±51198,262102±21161和538104±74142nmol・L-1,与正常对照组均有明显差异。

说明神经细胞对低糖低氧损伤的反应极为敏感,短时间(015h)的低糖低氧即可造成[Ca2+]i水平的明显升高,而较长时间(3h)的低糖低氧会引起严重的细胞内钙水平上升。

其他实验表明此时细胞损伤严重,功能几乎丧失,不利于药物作用的观察,因而我们选择低糖低氧处理1h作为神经细胞损伤模型,观察药物的作用。

2　NBP对低糖低氧所致神经细胞内游离C a2+升高的抑制作用
由图1可见,d2,l2和dl2NBP对低糖低氧处理1h所致[Ca2+]i升高均有明显抑制作用。

其中以l2NBP的作用最强,在011μmol・L-1时可使升高的[Ca2+]i(226161nmol・L-1)降至165118nmol・L-1,在110μmol・L-1时,[Ca2+]i进一步降至129109nmol・L-1,基本接近正常水平(101139 nmol・L-1)。

而d2NBP在110μmol・L-1时才出现类似的抑制作用,[Ca2+]i降低至161156nmol・L-1;在10μmol・L-1时,[Ca2+]i恢复到接近正常水平,为134131nmol・L-1。

dl2NBP的作用基本介于二者之间,也在110μmol・L-1时才表现出抑制[Ca2+]i升高的作用,使[Ca2+]i由262102降至207165nmol・L-1,在10μmol・L-1时,这一数值进一步降至164126nmol・L-1,基本恢复正常。

d2,l2和dl2NBP的作用强度均有一定的量效关系,高浓度时(10μmol・L-1)3者的作用强度趋于一致,均使升高的[Ca2+]i恢复到正常水平。

3者的作用表明它们对低糖低氧造成的细胞内钙升高均有较好的逆转作用。

Fig1　Effect of d2,l2and dl2NBP on the increase of intracellular calcium in rat fetal neurons subjected to1h2hypoxia/hypoglycemia compared with vehicle group. x±s,n=4.3P<0105,##(33)P<0101 compared with normal(vehicle)group.□Normal;　Vehicle;　011μmol・L-1;　1μmol・L-1;■10μmol・L-1.
3　NBP对零外钙时Thapsigargin所致胞内C a2+升高的抑制作用
外钙为零时,thapsigargin在2,10和50 nmol・L-1剂量均可迅速引起内质网钙库释放,造成神经细胞[Ca2+]i的升高,但作用并无明显量效关系(图2),只在给药后的1min内可以看出3种浓度下的thapsigargin作用强度稍有不同,达峰时间均在给药后110～115min,峰值均较低,最大内钙增长为4319nmol・L-1,并且作用达峰值后持续时间较短,为115～210min,随后逐渐减弱,而2nmol・L-1剂量组衰减较慢,因此本实验采用该剂量作为观察药物作用的浓度。

等体积DMSO对胞内钙水平未见明显作用。

在该条件下,d2,l2和dl2NBP对2nmol・L-1 Thapsigargin所致[Ca2+]i升高均有明显的抑制作用(图3),且dl2和l2NBP的作用比d2NBP要强,在011μmol・L-1时即表现出明显抑制作用,使[Ca2+]i 增加由40180nmol・L-1分别降至26148和30192 nmol・L-1,在110和10μmol・L-1浓度,亦有明显抑制作用;d2NBP的作用出现在110μmol・L-1, [Ca2+]i净增降为35129nmol・L-1,10μmol・L-1时为33117nmol・L-1。

Fig2　Increasing effect of different concentrations of
thapsigargin(Tha)on[Ca2+]i of neurons in the
absence of extracellular calcium.n=6.(○)DMSO;
(●)Tha2nmol・L-1;(△)Tha10nmol・L-1;(▲)
Tha50nmol・L-1.
Fig3　Effect of d2,l2and dl2NBP on the increase
of[Ca2+]i caused by2nmol・L-1thapsigargin in rat
fetal neurons in the absence of extracellular calcium.
x±s,33P<0101compared with vehicle group.
　011μmol・L-1;■1μmol・L-1;　10μmol・
L-1.
4　NBP对外源性谷氨酸诱导胎鼠和新生鼠神经细
胞内钙升高作用的影响
结果见表2。

200μmol・L-1谷氨酸虽能引起胎
鼠(孕期16～18d)神经细胞[Ca2+]i升高,且与正
常组相比也有显著性差异,但程度较小,净增值小于
30nmol・L-1。

在谷氨酸刺激的同时给予d2,l2,
dl2NBP共同处理,[Ca2+]i上升的水平并不降低,
10μmol・L-1dl2NBP甚至表现出略有升高的趋势。

总的来说,外源性谷氨酸对胎鼠神经细胞的作用较
小,NBP对此无影响,统计学差异的出现很大程度
上是由于很小的标准误。

而谷氨酸对新生鼠(出生3d)脑的影响强于它
在胎鼠脑的作用。

由表2可见,200μmol・L-1谷氨
酸可使[Ca2+]i净升高约80nmol・L-1。

此时手性
NBP的作用表现出较大差异,d2NBP能够抑制这种
形式的[Ca2+]i升高,而l2NBP和dl2NBP未见明
显作用。

此时M K2801表现出明显抑制[Ca2+]i升
高的作用。

5　NBP对外源性高K+及钙离子载体A23187引起
神经细胞内钙升高的影响
由表3可见,KCl及A23187均可引起胎鼠神
经细胞[Ca2+]i升高,其中KCl的作用较小,50
mmol・L-1浓度时使[Ca2+]i净增53119nmol・L-1,
而钙离子载体A23187的作用极强,011μmol・L-1
浓度即可使[Ca2+]i净增700nmol・L-1,形成严重
的钙超载。

d2,l2,dl2NBP在10μmol・L-1水平均
不能使这两种工具药引起的[Ca2+]i升高有所降
低。

T ab2　E ffects of d2,l2and dl2NBP on the increase of[C a2+]i in rat fetal or ne w born rat(3d)neurons induced by200μmol・L-1glutamine
Group Concentration/
μmol・L-1
[Ca2+]i/nmol・L-1
in fetal neurons
[Ca2+]i/nmol・L-1
in new born neurons
Normal 159.28±3.84 269.07±28.28 Vehicle G lutamate200187.23±3.72#345.30±36.30## d2NBP 0.1 186.39±4.36
1.0185.65±5.29
10183.90±5.18 271.83±43.573 l2NBP0.1198.41±7.42
1.0193.77±6.85
10198.71±9.47295.71±76.45
dl2NBP0.1174.49±8.97
1.0197.82±7.84
10217.33±10.463302.27±29.67
M K2801 1.0244.72±25.9333 x±s,n=4.#(3)P<0105vs normal(vehicle)group.
T ab3　E ffect of10μmol・L-1d2,l2or dl2NBP on the increase of[C a2+]i caused by A23187(011μmol・L-1)and K Cl(50mmol・L-1)in the presence of113mmol・L-1extracellular calcium
Group A23187KCl
Normal121.34±15.83 121.34±15.83
Vehicle813.57±84.35174.53±12.53
d2NBP833.92±46.28171.60±14.66
l2NBP892.63±57.32162.37±9.87
dl2NBP825.08±46.68165.83±8.23
x±s,n=4.
讨论
文献报道,缺血缺氧造成[Ca2+]i升高主要源于以下3种机制[9～11]:①能量的耗竭,导致离子稳态破坏,膜去极化,兴奋性氨基酸释放引起受体门控性通道激活,而引起外钙内流;②电压门控性钙通道激活,造成大量胞外钙内流;③线粒体和内质网钙库释放。

本实验用外源性谷氨酸,高K+,钙离子载体A23187及内钙释放剂thapsigargin作工具药,分别分析了NBP对上述3种机制造成的[Ca2+]i升高的影响。

①对于外源性谷氨酸所致的[Ca2+]i升高,除d2型外,dl2NBP和l2NBP均不产生抑制作用,说明l2,dl2NBP对NMDA受体的激活影响较小;
②d2,l2或dl2NBP均不能抑制由高K+和钙离子载体A23187引起的神经细胞内钙升高,表明NBP 对电压依赖性钙通道的激活无抑制作用,同时也不影响钙离子载体的作用。

本实验中给予高K+处理后[Ca2+]i升高不大,原因可能是由于所用K+浓度偏高,但NBP的这一作用是与我们以前的实验结果一致的[7];③d2,l2和dl2NBP均可部分抑制Thapsigargin引起的[Ca2+]i升高。

由于thapsigar2 gin的作用机制主要是通过抑制内质网膜上不依赖于IP3的Ca2+2A TPase,促进内质网释放贮存Ca2+,因而说明d2,l2和dl2NBP对内质网钙库的释放均有抑制作用。

所有这些结果表明NBP对受体门控(d2NBP除外)和电压门控性钙通道激活引起的[Ca2+]i升高基本无影响,其主要作用是抑制细胞内钙库的释放。

由于d2NBP能抑制低糖低氧造成的[Ca2+]i 升高,同时还对谷氨酸所致新生鼠神经细胞[Ca2+]i 升高表现出抑制作用,表明在低糖低氧时,d2NBP 的作用至少部分是由于它抑制了NMDA受体门控型钙通道。

可见dl2NBP抑制低糖低氧造成的[Ca2+]i升高,部分是由于d2NBP对NMDA受体门控型通道的抑制。

实验结果还显示新生鼠脑与胎鼠脑对兴奋性氨基酸(excitotic amino acid,EAA)的反应性不同,胎鼠脑有更强的EAA抗性,可能是由于新生鼠脑的谷氨酸受体门控型钙通道发育较完善[17]。

大量文献和我们已有的工作都表明,在脑缺血和低糖低氧过程中,线粒体的结构和功能都受到很大损伤,内膜通透性增大,膜电位减小,呼吸链复合酶活性降低,能量供应急剧减少,这些作用导致线粒体对钙离子的摄取和储存能力下降。

由于NBP能够改善脑缺血和低糖低氧细胞内的能量供应,并直接作用于线粒体,改善其膜电位和呼吸链功能[9],推测它必将大大增强线粒体对Ca2+的摄取储存能力,从而使[Ca2+]i水平降低。

这一推论尚有待今
后工作的进一步证明。

综合以上分析,d2,l2和dl2NBP均能完全抑制由低糖低氧引起的神经细胞[Ca2+]i升高,因而减少由[Ca2+]i升高造成的细胞损伤,发挥其良好的脑保护作用。

对其作用机制研究表明NBP主要通过抑制细胞内钙库释放来降低[Ca2+]i,d2NBP还可通过抑制NMDA受体的激活来降低[Ca2+]i,也可能包括对能量状态的改善作用,但没有对电压依赖型钙通道的抑制作用。

R eferences
　1　Feng YP,Hu D,Zhang L Y.E ffect of dl2butylphthalide (NBP)on mouse brain energy metabolism in complete
brain ischemia induced by decapitation.Acta Pharm S in
(药学学报),1995,30∶741
　2　Liu XG,Feng YP.Protective effect of dl232n2 butylphthalide on ischemic neurological damage and abnormal behavior in rats sub jected to focal ischemia.
Acta Pharm S in(药学学报),1995,30∶896
　3　Y an CH,Feng YP,Zhang J T.E ffects of dl232n2 butylphthalide on regional cerebral blood flow in middle cerebral artery occlusion rats.Acta Pharm S in(药学学
报),1998,12∶36
　4　Xiong J,Feng YP.E ffects of butylphthalide on the activities of complexes of the mitochondrial res piratory chain.Acta Pharm S in(药学学报),1999,34∶241　5　Xiong J,Feng YP.E ffect of dl2butylphthalide on the expression of HSP70mRNA and c2fos in transient cerebral ischemic and reperfused rat brain.Acta Pharm S in(药学学报),1998,33∶406
　6　Liu XG,Feng YP.E ffect of dl232nbutylphthalide on isolated tail artery contraction of rat induced by potassium chloride and norepinephrine.Chin J Pharm acol Toxicol
(中国药理学与毒理学杂志),1996,10∶113
　7　Lin J F,Feng YP.E ffect of dl232n2butylphthalide on delayed neuronal damage after focal cerebral ischemia and intrasynaptosomes calcium in rats.Acta Pharm S in(药学学报),1996,31∶166
　8　Grynkiewicz G,Poenie M,Tsien R Y,et al.A new generation of Ca2+in indicators with greatly improved fluorescence properties.J Biol Chem,1985,260∶3440　9　Kriatain T,Siesjo B K.Calcium in ischemic cell death.
S t roke,1998,29∶705
10　Siesjo B K,et al.Calcium fluxes,calcium antagonist, and calcium related pathology in brain ischemia, hypoglycemia,and s preading depression:a unifying hypothesis.J Cereb Blood Flow Metab,1989,9∶127
11　G illand E,Puka2Sundvall M,Hillered L,et al.
Mitochondrial function and energy metabolism after hypoxia2ischemia in the immature rat brain:involvement of NMDA2receptors.J Cereb Blood Flow Metab,1998, 18∶297
12　Bickler PE,et al.Development changes in intracellular calcium regulation in rat cerebral cortex during hypoxia.
J Cereb Blood Flow Metab,1993,13∶811
EFFECTS OF32n2BUTYLPHTHALIDE ON THE INCREASE OF
INTRACELL U LAR CALCIUM IN NEURONS SUBJECTED TO
H YPOXIA AND H YPOG LYCEMIA AND ITS MECHANISMS
Xiong Jie(Xiong J)and Feng Yipu(Feng YP)
(Instit ute of M ateria Medica,Chi nese A cadem y of Medical Sciences and
Peki ng U nion Medical College,Beiji ng100050)
ABSTRACT　AIM:To study the decreasing effects and the mechanisms of d2,l2and dl2butylphthalide (NBP)on intracellular calcium([Ca2+]i)in neurons subjected to hypoxia and hypoglycemia.METH ODS: Neurons were prepared from fetal or newborn rat brain and Fura22/AM was used as fluorescence indicator to study the actions of NBP on[Ca2+]i.Thapsigargin,glutamine,KCl or calcium ionpore A23187,which can induce increase of intracellular calcium,were used as tool drugs to analyze the mechanisms of the action of chiral NBP.RESU LTS:d2,l2and dl2NBP were shown to significantly inhibit the increase of intracellular calcium caused by hypoxia and hypoglycemia.However,chiral NBP was found to have no effect on the increase of [Ca2+]i induced by the tool drugs except thapsigargin.d2NBP seemed to have some decreasing effect on+ glutamate.CONCL USION:The actions of d2,l2and dl2NBP might be mediated mainly by its decreasing effect on the release of calcium from intracellular calcium pool.
KEY WOR DS　butylphthalide;hypoxia;hypoglycemia;intracellular calcium;Fura22/AM。