丁基苯酞对低糖低氧引起神经细胞内钙升高的作用

丁基苯酞对低糖低氧引起神经细胞内钙升高的作用

熊　杰,冯亦璞3

(中国医学科学院,中国协和医科大学药物研究所,北京100050)

摘要　目的:探讨抗脑缺血新药丁基苯酞(NBP)对脑缺血过程中细胞内游离钙升高的影响及其作用机制。方法:采用低糖低氧损伤胎鼠或新生鼠神经细胞以模拟脑缺血,用Fura22/AM作荧光指示剂,观察手性丁基苯酞对神经细胞内游离钙升高的抑制作用,并用内钙释放剂thapsigargin,外源性谷氨酸,高K+及钙离子载体A23187作工具药,对其作用环节进行分析。结果:d2,l2,dl2丁基苯酞能完全抑制低糖低氧造成的神经细胞内钙升高。手性NBP 能降低thapsigargin引起的内质网钙库释放,d2NBP还对谷氨酸引起的内钙升高表现出抑制作用。结论:丁基苯酞抑制低糖低氧条件下神经细胞内钙升高的作用环节主要是抑制细胞内钙库的释放。

关键词　丁基苯酞;低糖低氧;细胞内钙;钙离子荧光指示剂(Fura22/AM)

丁基苯酞(dl232n2butylphthalide,dl2NBP)是我所研制的抗脑缺血一类新药,药效学研究表明有良好的抗脑缺血活性[1～5]。以往在大鼠尾动脉环实验中曾发现dl2NBP能抑制去甲肾上腺素引起的细胞[Ca2+]i升高作用,而对外钙入胞无影响[6],同时大量实验还提示NBP对脑缺血时细胞内钙升高可能有抑制作用[7]。为此,我们用Fura22/AM作为荧光指示剂[8],采用双波长荧光分光光度法,观察了低糖,低氧或低糖低氧处理对大鼠胎鼠神经细胞[Ca2+]i水平的影响及手性丁基苯酞(d2,l2NBP)和消旋丁基苯酞(dl2NBP)的作用;并用内钙释放剂Thapsigargin,外源性谷氨酸,高K+以及钙离子载体A23187作工具药,分析了NBP对[Ca2+]i影响的可能作用机制。

材料与方法

动物　清洁级Wistar孕鼠,孕期16～18d,购于中国医学科学院实验动物繁殖中心。

药品与试剂　d2,l2和dl2NBP,由本所合成室杨靖华教授提供,黄色油状液体,纯度>96%。先溶于少量DMSO中,再加入4倍体积双蒸水,制成10-2mol・L-1的混悬液,再以双蒸水依次稀释至

收稿日期:1999204226

基金项目:国家科委1035工程重大项目基金(942ZD201)和国家自然科学基金重大项目基金资助项目(29790122) 3联系人　Tel:(010)63165173,Fax:(010)63017757,

E2mail:fengpy@ 10-3,10-4和10-5mol・L-1。Fura22/AM,本所合成室提供,溶于DMSO成1mmol・L-1溶液,-20℃分装保存。EGTA[ethylenegly colbis2(22aminoe2 thyl2ether)tetracetic acid]购于北京化学试剂公司,溶于3mol・L-1Tris中,成015mol・L-1溶液。BSA 和M K2801,购于Sigma公司;Triton X2100,购于香港FARCO化学公司;谷氨酸,购于Serva公司,均溶于019%生理盐水。Thapsigargin,购于Sigma公司,完全溶解于DMSO成3mmol・L-1溶液,-20℃分装保存,使用时以DMSO稀释。小于3μmol・L-1的稀释液只可一次性使用[12]。A23187,购于Sigma 公司,溶于DMSO。高糖(含D2葡萄糖415g・L-1)和低糖(含D2葡萄糖110g・L-1)DM EM培养基,购于GIBCO BRL公司。Hanks液(mmol・L-1): NaCl137,KCl5,CaCl2113,MgSO4・7H2O018, Na2HPO4・H2O016,KH2PO4014,NaHCO3310, G lucose516,p H712。

仪器　F24010双波长荧光分光光度计,日本Hitachi公司。

方法　Wistar孕鼠以10%水合氯醛(360 mg・kg-1,ip)麻醉后,取出胎鼠7～8只。将完整大脑半球置高糖DM EM中制成细胞悬液,经200目细胞筛过滤3次,经1000r・min-1离心5min,去上清液,正常对照组细胞悬浮于高糖DM EM中,低糖低氧组悬于Ar2饱和的低糖DM EM中,并以封口膜密闭。细胞数均在5×106个・mL-1,给药组同时加入药物,置37℃,含5%CO2环境中处理。处理后的样本经1000r・min-1离心5min,倾去上清液,所得

细胞重新悬浮于等体积Hanks液中,常规进行负载,清洗和细胞荧光测定。

观察药物作用时,神经细胞直接悬浮于Hanks 液中,进行负载和荧光测定。测定前对样品和DMSO均进行扫描,以消除药品和溶剂自身的荧光干扰。d2,l2或dl2NBP在工具药加入前2min加入样品池。

测定条件　Ex WL1340nm,Ex WL2380nm, Em WL500nm,Ex bandpass5nm,Em bandpass10nm,测定温度37℃。

数据处理　所测得各数据均减去细胞自发荧光值,给药组数据均减去细胞和药物自发荧光值,再代入Grynkiewicz公式[8][Ca2+]i=Kd(R-Rmin)/ (Rmax-R)×(Sf2/Sb2),计算细胞内游离钙浓度。全部数据均采用t检验进行统计学处理。

结果

1　低糖低氧损伤条件的确立

由表1可见,正常胎大鼠神经细胞[Ca2+]i水平较低,为142137±21153nmol・L-1;单纯低氧或单纯低糖处理细胞1h,并不影响[Ca2+]i水平;而低糖合并低氧处理细胞1h,则[Ca2+]i明显升高。

T ab1　Changes in[C a2+]i level in rat fetal neurons subjected to hypoxia,hypoglycemia or hypoxia/ hypoglycemia compared with normal group.H ypo: hypoxia/hypoglycemia

Group[Ca2+]i/nmol・L-1

Normal 142.37±21.53

Hypoxia-1h167.23±23.31

Hypoglycemia-1h140.42±27.17

Hypo.-0.5h249.02±51.9833

Hypo.-1h262.02±21.6133

Hypo.-3h538.04±74.4233

x±s,n=4.33P<0101vs normal.

由低糖低氧处理引起神经细胞内钙升高的时间曲线表明,胎大鼠神经细胞[Ca2+]i水平随低糖低氧时间的延长而持续升高。当处理时间分别为015 h(Hyp.-015h),1h和3h时,细胞[Ca2+]i水平分别达到249102±51198,262102±21161和538104±74142nmol・L-1,与正常对照组均有明显差异。说明神经细胞对低糖低氧损伤的反应极为敏感,短时间(015h)的低糖低氧即可造成[Ca2+]i水平的明显升高,而较长时间(3h)的低糖低氧会引起严重的细胞内钙水平上升。其他实验表明此时细胞损伤严重,功能几乎丧失,不利于药物作用的观察,因而我们选择低糖低氧处理1h作为神经细胞损伤模型,观察药物的作用。

2　NBP对低糖低氧所致神经细胞内游离C a2+升高的抑制作用

由图1可见,d2,l2和dl2NBP对低糖低氧处理1h所致[Ca2+]i升高均有明显抑制作用。其中以l2NBP的作用最强,在011μmol・L-1时可使升高的[Ca2+]i(226161nmol・L-1)降至165118nmol・L-1,在110μmol・L-1时,[Ca2+]i进一步降至129109nmol・L-1,基本接近正常水平(101139 nmol・L-1)。而d2NBP在110μmol・L-1时才出现类似的抑制作用,[Ca2+]i降低至161156nmol・L-1;在10μmol・L-1时,[Ca2+]i恢复到接近正常水平,为134131nmol・L-1。dl2NBP的作用基本介于二者之间,也在110μmol・L-1时才表现出抑制[Ca2+]i升高的作用,使[Ca2+]i由262102降至207165nmol・L-1,在10μmol・L-1时,这一数值进一步降至164126nmol・L-1,基本恢复正常。d2,l2和dl2NBP的作用强度均有一定的量效关系,高浓度时(10μmol・L-1)3者的作用强度趋于一致,均使升高的[Ca2+]i恢复到正常水平。3者的作用表明它们对低糖低氧造成的细胞内钙升高均有较好的逆转作用

。

Fig1　Effect of d2,l2and dl2NBP on the increase of intracellular calcium in rat fetal neurons subjected to1h2hypoxia/hypoglycemia compared with vehicle group. x±s,n=4.3P<0105,##(33)P<0101 compared with normal(vehicle)group.□Normal;　Vehicle;　011μmol・L-1;　1μmol・L-1;■10μmol・L-1.