噬菌体展示技术及其在抗原表位筛选中的应用-生物淘

Ph.D.系统类型
根据所用噬菌体类型的不同，又可以分为丝状 噬菌体(M13，fd,f1)展示系统、λ 噬菌体展示 系统、T4噬菌体展示系统、T7噬菌体展示系统、 噬菌粒展示系统等。
λ 噬 菌 体 展 示 系 统
T4噬菌体展示系统
1.T4噬菌体病毒颗粒是在宿 主细胞内组装，被组装的 融合蛋白无需通过质膜， 不需要通过分泌途径，因 而其表面展示多肽和蛋白 的范围广。同时噬菌体还 能在体外组装，这对构建 表面展示噬菌体十分方便。 2. T4噬菌体展示周期在基于 T4生命的非必需衣壳蛋 白SOC和HOC。
Ph.D.筛选抗原表位的优点
在抗原表位的研究中，使用噬菌体肽库作为筛选工具的 优点： 1. 可以呈现出“靶分子—模拟位”反应的自然态。小型 外源肽的定向插入对噬菌体正常的生活周期影响甚微， 这有利于表位潜力基因的顺利表达和保持天然的构象。 2. 高通量筛选。噬菌体肽库的库容一般可达109～1012， 足以将靶分子的配体从中挑选出来。 3. 易于纯化。由于M13噬菌体是非裂解噬菌体，成熟 的噬菌体分泌到培养上清中，可通过沉淀剂将绝大部分 噬菌体粒子沉淀下来，从而获得富集的阳性噬菌体克隆。
Ph.D.概念
噬菌体展示：将外源肽或蛋白与特定噬菌体衣 壳蛋白融合并展示于噬菌体表面，进而通过筛 选表达有目的肽或蛋白质的噬菌体，得到大量 富集，然后通过DNA序列测定进行定性。
融合蛋白
Baidu Nhomakorabea
M13噬菌体展示外源基因模式图
因此，噬菌体展示技术堪称表型与基因型的统 一。外源蛋白或多肽的表型和基因型被统一在 了同一噬菌体颗粒内，通过表型筛选就可以获 得其编码基因。
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噬菌体展示技 术
Ph.D.由来
1985年，Smith首次将外源基因插入丝状噬菌体f1的基 因Ⅲ，使目的基因编码的多肽以融合蛋白的形式展示 在噬菌体表面，从而创建了该技术。 1988年Parmley发现已知抗原决定簇与PⅢ的N端融合在 噬菌体表面后，可特异性地被抗体选中，因此提出了 通过构建随机肽库了解抗体识别的抗原表位的设想。 1990年Scott将噬菌体随机多肽库成功应用于筛选抗原 表位，之后国内外学者进行了大量的相关研究，有力 地推动了病毒抗原表位的研究进程。
Ph.D.的应用前景
近几年来，噬菌体展示技术在应用研究方面显 示出极大的实用性，一些极具应用前景的产品 如TPO、抗病毒多肽疫苗、肿瘤相关抗原p53 等正处于国际知名公司和研究机构的研究开发 之中。 可以预测噬菌体表面展示技术及蛋白质三级结 构预测、分子模拟技术的融合，将推进重组抗 体、模拟表位、受体作用、酶学机制以及生物 疫苗等动物病毒学领域的进程。
谢谢！
噬菌体展示技术及其在抗原表 位筛选中的应用
报告人：张瑞华 2010年11月
噬菌体
噬菌体是感染细菌、支原体、螺旋体、放线菌 以及蓝细菌等的一类病毒，亦称细菌病毒。 噬菌体的结构简单，基因数较少，已成为分子 生物学研究的重要工具；另外，因其还可作基 因的载体，故又被广泛应用于遗传工程的研究。
噬菌体
Ph.D.技术的局限性
作为一种应用工具，噬菌体展示技术也有自己的局限 性，主要表现在： 1.该技术始终需要借助于其它的分析系统，如表位预测、 蛋白分析、原核表达等辅助性系统以及其他各种设计 合理的实验性平台，共同完成抗原表位的精确定位。 2.在该系统中细胞毒性分子和真核生物蛋白难以表达和 展示；构象型表位由于不具备线性表位的“一体性” 结构，所以研究难度相对增大，即使采用富含loops 的肽库遴选表位模拟物，与天然的蛋白构象之间仍然 会存在些许偏差。
Ph.D.生物淘洗程序示意图
包被靶分子并加入肽库，肽库特异 性吸附靶分子 洗去未结合的噬菌体 洗得特异性结合的噬菌体
于ER2738扩增后进行下一轮淘洗
用Ph.D.-12肽库测定 抗原决定簇。用抗®内啡肽单克隆抗体对 Ph.D.-12展示肽文库 进行液相淘选的结果。 每轮淘选所选到的结 合序列与®-内啡肽的 前12个氨基酸残基序 列比较列于上图内， 共有序列元件用方框 示出。
M13噬菌体展示系统
Ph.D.-12TM噬菌体展示肽 库试剂盒将随机十二肽 融合到M13噬菌体次要衣 壳蛋白（pⅢ）上，因此 是一个组合文库。
融合蛋白模式图
K = G or T; M = A or C
随机十二肽-gⅢ融合蛋白的N末端序列
精 简 密 码 子 表
文库的随机序列区域仅用32个密码子编码所有20种氨基酸。 这使单密码子氨基酸的出现频率相对较高，同时排除了三个 终止密码子中的两个。在构建该文库的菌株中，琥珀终止子 TAG (*)可被Gln抑制。