Rac1在肝癌细胞株生长和侵袭中的意义

Rac1在肝癌细胞株生长和侵袭中的意义
【摘要】目的：证实Rac1在肝癌细胞的生长与侵袭中的意义，寻找可能的肿瘤基因治疗新靶点。

方法：特异性抑制Rac1蛋白表达的siRNA干扰肝癌高转移细胞株97H，观察肝癌高转移细胞株97H 内Rac1表达、细胞生长、肿瘤细胞的活力和体外侵袭力的变化。

结果：肝癌高转移细胞株97H内Rac1表达、细胞生长受抑制，肿瘤细胞的活力和体外侵袭力显著降低。

结论： Rac1表达的减少能够显著抑制肝癌细胞的生长和侵袭，可能成为肿瘤基因治疗新的靶点。

【关键词】 Rac1 肝癌高转移细胞株 siRNA 移
［Abstract］Objective: To prove Rac1 might play an important role in the proliferation and transference of hepatoma cell.Methods： small interference RNA technique was employed to knock down gene expression of Rac1 in hepatoma cell line 97H. Results： The protein level of Rac1, the cell proliferation, the cell vitality and the ability to invade the reconstituted basement membrane were decreased dramatically after transfection with a Rac1specific siRNA vector. Conclusion：Rac1 might play an important role in the development, progression,transference of hepatoma and also provide a possible strategy for the interference of tumor angiogenesis by targeting the Rac1.
［Key words］ Rac1; hepatoma cell; siRNA;transference
肝癌的基因治疗正在不断探索中,表达调控治疗是肝癌基因治疗的重要策略。

在先前的研究中我们发现肝癌细胞株Rac1的表达显著高于正常肝细胞株，提示Rac1与肝癌的生长和转移有密切的关系［1］。

本次研究我们运用RNA干扰技术，调控信号分子的表达，进一步证实Rac1与肝癌生长转移的关系，为肝癌的基因治疗寻找新的靶点。

1 材料与方法
1.1 材料
肝癌高转移细胞株97H由复旦大学附属中山医院肝癌研究所分离和保存。

LipofectamineTM 2000购自Invitrogen公司；兔抗人Rac1购自Santa Cruz公司；鼠抗人的βactin购自R&D公司；HRP标记山羊抗鼠二抗，HRP标记山羊抗兔二抗购自Biochemicol公司；细胞裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂盒购自上海申能博彩公司；PVDF 膜购自华舜公司；Costar TranswellTM培养板（3422，孔径8μm，直径 6.5 mm），购自Corning公司；Trigel Basement Membrane Matrix(356237, Phenol Red free),购自BD公司；siRNA由上海化学基因公司合成。

1.2 研究方法
肝癌高转移细胞株97H用含10%小牛血清的DMEM培养液置于37℃，5%CO2的培养箱中培养。

1.2.1 siRNA合成在基因库中查到人Rac1基因序列（编号是NM_198829），输入到RNAi设计软件中，得到4个siRNA片段序列，选择特异性最好的三种加上文献报道的针对大鼠Rac1的一段序列，序列
如下：
1号siRNA：5′UGUCCGUGCAAAGUGGUAUtt3′
5′AUACCACUUUGCACGGACAtt3′
2号siRNA：5′UCCUAUCCGCAAACAGAUGtt3′
5′CAUCUGUUUGCGGAUAGGAtt3′
3号siRNA：5′CUUUGCAAAGACCUUCGUCtt3′
5′GACGAAGGUCUUUGCAAAGtt3′
4号siRNA：5′GUUCUUAAUUUGCUUUUCCtt3′
5′GGAAAAGCAAAUUAAGAACtt3′
上述siRNA由上海化学基因公司合成，分别为5 nmol，另未知序列的对照siRNA也购自上海化学基因公司。

5 nmol siRNA溶于250 μl退火缓冲液中，分装后置于－70℃冰箱保存。

1.2.2 分组筛选正常对照组为c组，对照siRNA为0组，此次设计的分别为1，2，3组，文献报道的针对大鼠Rac1的siRNA为4组。

经中山医院钱成博士筛选，选定2号组作为本实验用siRNA。

1.2.3 LipofectamineTM 2000介导的siRNA干扰将细胞接种于六孔板，生长至60%～80％融合，干扰前24小时，PBS洗涤两次，更换为不含抗生素的DMEM培养液1 ml。

再取30 μl含siRNA的退火缓冲液加入470 μl Opti MEMⅠ；另取一离心管，分别加入30 μl LipofectamineTM 2000和120 μl Opti MEMⅠ室温孵育7～10 min。

混合上述两种溶液（用倒转法），室温孵育20～25 min，溶液变
混浊。

此时再加入新鲜的Opti MEM溶液320 μl，总容量调整为1 000 μl。

将1 000 μl siRNA－LipofectamineTM 2000加入前一天更换的无抗生素培养液中去，此时的siRNA的终浓度为50 nmol/L。

6 h后加无抗生素含10％胎牛血清的培养液至3 ml/孔，两天后用于实验。

1.2.4 蛋白提取和Western blot印迹用RIPA加PMSF裂解细胞，BCA法测定蛋白浓度，在基本保持蛋白上样量相等的情况下行蛋白电泳，半干后电转移至 PVDF膜上，丽春红染色，剪下相应的蛋白条带，5%的脱脂奶粉封闭4 h，加相应的一抗，4℃过夜，TBST洗膜3次，再加相应的HRP标记的二抗，室温下孵育1 h，用TBST洗膜3次，加发光剂，ECL发光检测。

1.2.5 细胞生长曲线与细胞活力的测定取干扰组、未干扰组、加入脂质体组的97H肝癌细胞培养液接种于96孔细胞培养板上，培养 5 d。

酶联免疫检测仪测定各孔光密度（D），绘制生长曲线。

MTT 法分别测定1，3，5天的细胞活力，以光密度（D）表示。

肿瘤细胞抑制率=［对照组平均D(495 nm)干扰组平均D(495 nm)］/对照组D（495 nm)
1.2.6 细胞体外侵袭能力测定用Transwell小室进行细胞侵袭重建基膜实验。

Matrigel胶用无血清DMEM培养液稀释，加入到滤膜上表面，室温下通风橱中干燥过夜。

将干扰组、未干扰组、加入脂质体组的97 H细胞用无血清培养液洗3次，消化后重悬于无血清DMEM培养基中，取5×104/ml细胞100 μl加入至上室，600 μl 10%小牛血清培养基
加入下室。

37℃，5％CO2条件下培养20 h后，去除滤膜上层细胞，取下滤膜，行Gimsa染色，镜下计数滤膜下表面细胞数，随机计数5个视野中的细胞数目，每个标本重复2次，实验重复2次，求得平均数和标准差，以侵袭细胞的相对数目来表示肿瘤细胞的侵袭能力。

1.3 统计学分析
运用SPSS软件进行单因素方差分析。

2 结果
2.1 经siRNA干扰后97H肝癌细胞株Rac1蛋白表达
选择未干扰组和加入脂质体组做对照。

图1显示在总蛋白上样量基本保持一致的前提下（βactin条带亮度基本相同），Rac1在各组中的表达。

可以看到Rac1在siRNA干扰后的97H肝癌细胞株中的灰度明显低于对照组（未干扰组和仅加入脂质体组）。

用Alpha Imager软件对感光胶片进行灰度分析，以目的条带（Rac1）与内参照（βactin）的比值代表目的蛋白的表达水平，运用SSPS软件进行统计学处理，分析结果如图2。

可以看到Rac1条带在siRNA干扰后97 H肝癌细胞株中与βactin条带灰度值之比明显低于未干扰组和仅加入脂质体组的灰度值之比。

上述差异有统计学意义（P<0.01）。

2.2 siRNA干扰后细胞生长曲线的变化
siRNA干扰后能显著抑制肝癌高转移细胞株97H的生长，记录第1，2，3，4，5天的光密度（D）。

绘出生长曲线（图3）。

第5天时干扰组细胞数约为对照组（未干扰组和加入脂质体组）的70%，差异有统计学意义（P<0.05）。

图3 各组细胞生长曲线
Fig 3 Cell growth curve of each group
2.3 经siRNA干扰后97H肝癌细胞活力的改变和siRNA对肿瘤细胞抑制率的测定
与未干扰组和仅加入脂质体组相比，在同一时间点干扰组细胞活力显著下降，肿瘤抑制率在30%左右。

表明siRNA干扰能显著抑制97 H肝癌细胞株的活力和生长。

2.4 肝癌细胞体外侵袭能力的改变
siRNA干扰后由于细胞内Rac1蛋白的显著减少，使细胞穿透Matrigel胶处理后的Transwell小室的能力下降。

侵袭至Transwell 小室滤膜下表面的细胞数每高倍视野干扰组为（280±10.2）个，显著低于未干扰组［（350±12.4）个］和仅加入脂质体组［（345±8.5）个］，侵袭率和侵袭抑制率分别为80%和20%。

3 讨论
Rac1是Ras信号途径的下游小分子蛋白，在不同细胞过程如基因表达、细胞运动、增殖和凋亡中起着关键性的调节作用。

Rac1在一些肿瘤，如乳腺癌、结肠癌、睾丸细胞癌、胰腺癌、头颈部肿瘤、胃癌中的表达均有增高［2 -5］。

我们在先前的研究中也发现Rac1在肝癌细胞中的表达显著增高［1］。

Xue等［6］在对胃癌细胞的研究中发现， Rac1特异的siRNA干扰胃癌细胞株，能高效抑制肿瘤细胞的增殖。

他们的研究还表明，这种抑制作用可能是通过抑制血管内皮细胞生长因子的分泌来完成的。

吴富明等［7］的研究提示Rac1与卵巢癌侵袭转移相关。

现在已经明确的是Rac1与肿瘤基因的多个阶段有关，
干扰 Rac1的表达可能为肿瘤的基因治疗开辟新的策略。

RNA干扰技术是近几年发展起来的一项特异性抑制基因表达的方法。

RNA干扰现象首次在线虫中发现，不久，在真菌、植物、果蝇、锥虫、涡虫、水螅、斑马鱼等真核生物中都发现了RNAi现象。

目前，在人、小鼠及其他哺乳动物中，RNAi已经被广泛用来进行基因功能的研究，同时RNAi技术作为一种基因治疗手段为人类战胜重大疾病带来希望。

例如2002年5月，美国科学家Lindenbach等［8］报道，采用21个核苷酸双链DNA形成双链RNA，加入到感染艾滋病病毒的细胞中，24 h后，可减少艾滋病病毒基因表达90％以上。

RNAi介导的转录后基因沉默是高效、特异的。

可能作用机制是siRNA双链结合一个核酶复合物从而形成所谓RNA诱导沉默复合物(RNA inducedsilencingcomplex，RISC)，激活的RISC通过碱基配对定位到同源mRNA转录本上，并切割mRNA，促使mRNA降解，抑制mRNA 翻译形成蛋白质或多肽，从而有效地抑制了靶向基因蛋白质或多肽的合成。

而且，在RNAi途径中存在着某个扩增的过程。

这种扩增可能在RNA诱导沉默复合物(RISC)形成过程进行，作为RISC形成的补充，或者独立于RISC 。

在本次研究中首次选用针对人Rac1基因序列（基因库编号NM_198829）由RNAi设计软件设计的siRNA 片段对肝癌高转移细胞株97H进行RNA干扰。

其结果显示干扰组Rac1的蛋白表达明显低于对照组（未干扰组和加入脂质体组），说明此段siRNA 片段确实对肝癌高转移细胞株97H细胞株中Rac1的蛋白表达有着明显的、高效
的抑制作用。

在同时对肝癌97H细胞株的生长曲线、细胞活力、肿瘤抑制率的研究中发现：Rac1的蛋白表达显著减少的情况下，干扰组与对照组相比，细胞数量显著减少、细胞活力显著下降、肿瘤抑制率显著增加，表明Rac1的阻断对肝癌细胞的生长、增殖起着显著性抑制作用。

这一结果和Xue等［6］对胃癌细胞的研究结果是相一致的。

本研究还发现，运用特异siRNA对肝癌高转移细胞株97H进行RNA干扰后，在Rac1蛋白表达抑制的情况下，侵袭至transwell 小室滤膜下表面的细胞数明显减少、肿瘤细胞侵袭重建基膜能力受到显著抑制。

肿瘤细胞的迁移行为是肿瘤细胞侵袭转移的重要环节。

这一结果显示Rac1的阻断对抑制肿瘤的转移也起着重要的作用，证实了我们先前的推断［1］。

这些研究揭示了Rac1在肿瘤的发生、发展和转移中的重要作用，同时也显示运用siRNA阻断Rac1在肿瘤细胞中的表达具有潜在的临床应用价值。

Rac1可能成为肿瘤基因治疗新的靶点，特异性针对Rac1的siRNA 对Rac1增高的肿瘤可能是一种有效的治疗策略。

【参考文献】
［1］郑红,张学光.GTPase在肝癌细胞系中的表达和意义［J］.中国临床医学，2004，11（5）：779-780
［2］ Fritz G, Brachetti C, Bahlmann F, et al.RhoGTPases in human breast tumours: expression and mutation analyses and correlation with clinical parameters［J］.Cancer,2002, 87
（6):635-644
［3］ Kleer CG, van Golen KL, Zhang Y,et al.Characterization of RhoC expression in benign and malignant breast disease: a potential new marker for small breast carcinomas with metastatic ability［J］.Am J Pathol,2002, 160(2): 579-584.
［4］ Kamai T, Arai K, Sumi S, et al.The rho/rho kinase pathway is involved in the progression of testicular germ cell tumour［J］.BJU Int, 2002, 89(4): 449-453.
［5］ Pan Y, Bi F, Liu N,et al.Expression of seven main Rho family members in gastric carcinoma［J］.Biochem Biophys Res Commun,2004,315(3): 686-691.
［6］ Xue Y, Bi F, Zhang X, et al.Inhibition of endothelial cell proliferation by targeting Rac1 GTPase with small interference RNA in tumor cells［J］.Biochem Biophys Res Commun, 2004, 320(4): 1309-1315.
［7］吴明富,史艳燕,韩志强,等.人卵巢癌组织中Tiam1和Rac1的表达与肿瘤侵袭转移的关系［J］.中国肿瘤临床,2005,16(4),906-909.
［8］ Lindenbach BD, Rice CM.RNAi targeting an animal virus: news from the front［J］. Mol Cell,2002, 9(5): 925-927.。