细胞系的建立及鉴定
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1.细胞悬液的计数 得到1X105个/ml
2.确定各实验浓度所需的细胞悬液总量 要求：100ul/孔X（3孔+2孔）＝500ul
3.计算各浓度细胞悬液所需的细胞数
① 104/孔/100ulX5孔＝5X104/500ul ② 0.84/孔/100ulX5 ＝4X104/500ul ③ 0.64/孔/100ulX5 ＝3X104/500ul ④ 0.44/孔/100ulX5 ＝2X104/500ul ⑤ 0.24/孔/100ulX5 ＝1X104/500ul
4.计算500ul培养基内需加入多少
ml1X105个/ml的细胞悬液
① 500ul原液 ② 4X104 / 10X104 =0.4ml原液+0.1ml培养液 ③ 3X104 / 10X104 =0.3ml原液+0.2ml培养液 ④ 2X104 / 10X104 =0.2ml原液+0.3ml培养液 ⑤ 1X104 / 10X104 =0.1ml原液+0.4ml培养液
破骨细胞含有丰富的酸性磷酸酶和抗酒石酸 磷酸酶（tartrat resisitant acid phosphatase,TRAP），TRAP染色阳性是 破骨细胞的重要标识。另外破骨细胞表面有 降钙素（calcitonin）受体，也可以作为标 志物。
形态学：多核细胞
牙髓干细胞：需多少个指标证实
影响移植瘤生成的因素
（1）植入细胞与宿主的免疫不相容：如接种 的培养细胞来自纯种动物，接种时产生的抗 原变化可能会产生致癌的阴性结果。可以将 细胞接种到 “不受免疫影响”的部位（如 眼前房） 用射线或免疫抑制剂抑制宿主的免疫反应； 将细胞接种到免疫反应有先天性遗传缺陷的 动物：（如无胸腺裸小鼠）。
2. 细胞系具有肿瘤细胞的特性: 异种体内移植致瘤性
3. 体外无限生存的能力: 细胞系连续传代60或80代次。
肿瘤细胞的生物学特征
干系细胞：每个肿瘤内都含有一个或几个具有相对 稳定特性的自我保持的（Selfmaintaining）细胞 系。肿瘤的生长就是这些细胞系的增殖；
非干系细胞：除了干系瘤细胞，肿瘤还具有失去自 我保持能力的细胞的后代，可称为“肿瘤的非干系 细胞”。
动物接种形成的肿瘤应进行组织学、染色体 及其它生物学标志的检查并与原接种细胞进 行比较。
致瘤性的判断
移植瘤是判断细胞性质的关键步骤。 首先，移植瘤的组织形态应与原肿瘤组织一
致。但有例外，细胞群体的性质可以与植入 前不同，因为在植入的细胞中，只有特殊变 异的细胞具有致瘤性，这些变种可能原来就 存在于植入群体内，也可能是植入后产生的。 在这种情况下可以确认接种的致瘤性。
牙周膜干细胞：
干细胞表面标记物: 多潜能功能－－组织细胞分化及功能鉴定
分化为脂肪细胞： 油红O 染色阳性
肿瘤细胞系的生物学鉴定
肿瘤细胞系建立后,要对其生物学性状进行 鉴定,以便日后的研究有可比较的科学依据
肿瘤细胞系的基本特性
1.细胞系的来源符合原供体组织的病理学诊断 原供组织的组织病理形态； 动物接种肿瘤组织的组织形态；
细胞系的建立及鉴定
2012.2.28
细胞系：
有限细胞系，人的正常组织多数可以建立有 限细胞系。如间充质来源的成纤维细胞，牙 髓细胞、牙髓干细胞、牙周膜细胞等
无限细胞系，永生化细胞系，肿瘤细胞系
细胞系/细胞的鉴定
细胞系的建立：
1.组织块方法
2.单层细胞法
原代培养
传代培养
大量扩增细胞后用于实验研究
120 100 80 60 40 20
0
1 2பைடு நூலகம்3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
培养天数
肿瘤细胞系的特征：
特殊标记、癌基因、抑癌基因的表达、病毒 感染等；
以上各项指标中异种体内移植致瘤性最 为主要,如果一个细胞系接种到免疫缺陷动 物体内的适当部位后不能生瘤,则不能证明 其具有肿瘤细胞的特征。
目前，多用裸小鼠评价培养细胞的致瘤性。
（2）植入部位 ，例如，将瘤细胞接种到小鼠 躯干接近头部位置的皮下，生瘤的阳性率及 生长的速度比植到尾部高2－4倍。
（3）植入部位微环境的潜在因素，某些细胞 只有在植入部位找到最佳的微环境时才形成 肿瘤。
生瘤性与细胞其它性质的关系
细胞在基质上铺展的面积与生瘤性有关。 微丝束的结构破坏。许多生瘤细胞系均有大
肿瘤细胞系的一般生物学性状:
培养细胞的形态和/或超微结构 细胞生长及增殖能力的检测:
细胞生长曲线； 细胞分裂指数； 细胞倍增时间； 细胞周期,DNA合成； 遗传性状检测： 染色体分析:倍体性、染色体众数、核型分析； 同工酶； 集落形成能力；
细胞数 104/ml
图 -1 细胞生长曲线
动物肿瘤移植实验证实，肿瘤结节在新宿主身上多 次传代之后仍具有原来肿瘤的主要特征，包括形态、 生化、抗原及细胞遗传的标志。所有恶性肿瘤的转 移瘤结节的细胞都具有与亲代原发病损类似的形态 学及生物学性质。
培养中的肿瘤细胞特性
1．致瘤性： 培养的肿瘤细胞移植到敏感动物后，可获得 形成肿瘤的能力。证明细胞在体外能经过类 似于体内肿瘤发生过程中出现的变化。
永生化细胞系的鉴定：
除一般生物学性状外
1. 不死性，代次， 2. 细胞特性的改变： 3. 转染基因的鉴定：PCR, Southern blot ,
证实HPV-16/18 DNA 4. 成瘤性实验：免疫缺陷动物皮下细胞移
细胞悬液的制备
要求：5个浓度的细胞悬液分别是： 10000个；8000个；6000个；4000 个；2000个/100ul/孔 每个浓度3个复孔
恶性转化细胞对密度依赖性抑制的敏感性在肿瘤演 化的过程中自动丢失。
3．获得永生性
正常细胞原代培养物经过数次传代就逐渐停止 增殖。在肿瘤性演化过程中，细胞可能获得生长无 限代数的能力。永生性是肿瘤演化的一个特征。
成纤维及上皮细胞的原代培养经过初期的适应 培养条件之后，便进入较稳定的生长时期，生长速 度逐渐下降，进入退化期即衰老期。细胞系的寿命 差别很大，取决于培养细胞来自的动物种属。
丧失生长抑制性
当培养细胞所需任何一种关键性营养物质或生长因子 降到阈值以下时,正常细胞的生长即受到抑制,如异 亮氨酸,磷酸盐,上皮生长因子等。
转化的细胞对一些生长因子需求降低,或失去了对激素 和生长因子的需求，在营养不足的情况下可继续生 长,它们甚至可以杀死一些自身的细胞,以便在不可 能生存的环境下继续生长。或者由于某些转化产生 了生长因子类似物,为自身提供了生长因子。
密度依赖性抑制
正常贴壁性细胞的增殖率,随着每单位基质面积 内的细胞群体的局部密度增加而下降。这一现象称 为密度依赖性抑制(density dependent inhibition) 。或生长接触抑制(contact inhibition of growth),但二者并不等同。当一个对密度依
赖性抑制敏感的培养细胞达到某种密度，即所谓饱和密度时便停 止生长。此时细胞停止增殖，但并不死亡。这种抑制可以由于液 体培养基中的营养物质耗尽,生长抑制物质的累积所引起。
量的微丝束变化，它与形态转化有关。 停泊依赖性与生瘤性联系最密切。
在动物体内不形成肿瘤的细胞系，在半固体 培养基内形成集落的能力也低；与之相反， 而大多数能在动物体内生瘤的细胞系，形成 集落的效率也高。
2．生长参数和细胞行为的变化
丧失停泊依赖性（anchorage dependency）
一般情况下，原代成纤维及上皮细胞悬浮 培养时不能增殖，它们只有铺展在固体基质 上才能增殖。在肿瘤性演化过程中，相当一 部分的细胞群体获得在悬浮状态形成集落的 能力，并不需贴附在基质上。
使用前对细胞的组织特异性进行鉴定
成骨细胞：没有唯一的特异性标志物 需数个指标联合证实
表面标志： 表达ALP。 Gomarri 法
合成Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、骨钙素、骨粘 蛋白、骨桥蛋白等骨基质蛋白。
组织功能： 体外形成矿化结节。 von Kossa染色法
体内成骨。免疫缺陷鼠皮下移植。
破骨细胞：唯一特异性标志物
干细胞表面标志：CD44,STROL 1,MUC18 ,alpha-SM actin
多潜能功能鉴定： 成骨细胞功能： 细胞碱性磷酸酶（ALP）活性检测：采用 Gomarri 法测定细胞内碱性磷酸酶的活性。
细胞体外矿化能力的检测：细胞经矿化诱导
剂处理后，用von Kossa染色法观察细胞在体外 形成矿化物沉积的能力。
2.确定各实验浓度所需的细胞悬液总量 要求：100ul/孔X（3孔+2孔）＝500ul
3.计算各浓度细胞悬液所需的细胞数
① 104/孔/100ulX5孔＝5X104/500ul ② 0.84/孔/100ulX5 ＝4X104/500ul ③ 0.64/孔/100ulX5 ＝3X104/500ul ④ 0.44/孔/100ulX5 ＝2X104/500ul ⑤ 0.24/孔/100ulX5 ＝1X104/500ul
4.计算500ul培养基内需加入多少
ml1X105个/ml的细胞悬液
① 500ul原液 ② 4X104 / 10X104 =0.4ml原液+0.1ml培养液 ③ 3X104 / 10X104 =0.3ml原液+0.2ml培养液 ④ 2X104 / 10X104 =0.2ml原液+0.3ml培养液 ⑤ 1X104 / 10X104 =0.1ml原液+0.4ml培养液
破骨细胞含有丰富的酸性磷酸酶和抗酒石酸 磷酸酶（tartrat resisitant acid phosphatase,TRAP），TRAP染色阳性是 破骨细胞的重要标识。另外破骨细胞表面有 降钙素（calcitonin）受体，也可以作为标 志物。
形态学：多核细胞
牙髓干细胞：需多少个指标证实
影响移植瘤生成的因素
（1）植入细胞与宿主的免疫不相容：如接种 的培养细胞来自纯种动物，接种时产生的抗 原变化可能会产生致癌的阴性结果。可以将 细胞接种到 “不受免疫影响”的部位（如 眼前房） 用射线或免疫抑制剂抑制宿主的免疫反应； 将细胞接种到免疫反应有先天性遗传缺陷的 动物：（如无胸腺裸小鼠）。
2. 细胞系具有肿瘤细胞的特性: 异种体内移植致瘤性
3. 体外无限生存的能力: 细胞系连续传代60或80代次。
肿瘤细胞的生物学特征
干系细胞：每个肿瘤内都含有一个或几个具有相对 稳定特性的自我保持的（Selfmaintaining）细胞 系。肿瘤的生长就是这些细胞系的增殖；
非干系细胞：除了干系瘤细胞，肿瘤还具有失去自 我保持能力的细胞的后代，可称为“肿瘤的非干系 细胞”。
动物接种形成的肿瘤应进行组织学、染色体 及其它生物学标志的检查并与原接种细胞进 行比较。
致瘤性的判断
移植瘤是判断细胞性质的关键步骤。 首先，移植瘤的组织形态应与原肿瘤组织一
致。但有例外，细胞群体的性质可以与植入 前不同，因为在植入的细胞中，只有特殊变 异的细胞具有致瘤性，这些变种可能原来就 存在于植入群体内，也可能是植入后产生的。 在这种情况下可以确认接种的致瘤性。
牙周膜干细胞：
干细胞表面标记物: 多潜能功能－－组织细胞分化及功能鉴定
分化为脂肪细胞： 油红O 染色阳性
肿瘤细胞系的生物学鉴定
肿瘤细胞系建立后,要对其生物学性状进行 鉴定,以便日后的研究有可比较的科学依据
肿瘤细胞系的基本特性
1.细胞系的来源符合原供体组织的病理学诊断 原供组织的组织病理形态； 动物接种肿瘤组织的组织形态；
细胞系的建立及鉴定
2012.2.28
细胞系：
有限细胞系，人的正常组织多数可以建立有 限细胞系。如间充质来源的成纤维细胞，牙 髓细胞、牙髓干细胞、牙周膜细胞等
无限细胞系，永生化细胞系，肿瘤细胞系
细胞系/细胞的鉴定
细胞系的建立：
1.组织块方法
2.单层细胞法
原代培养
传代培养
大量扩增细胞后用于实验研究
120 100 80 60 40 20
0
1 2பைடு நூலகம்3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
培养天数
肿瘤细胞系的特征：
特殊标记、癌基因、抑癌基因的表达、病毒 感染等；
以上各项指标中异种体内移植致瘤性最 为主要,如果一个细胞系接种到免疫缺陷动 物体内的适当部位后不能生瘤,则不能证明 其具有肿瘤细胞的特征。
目前，多用裸小鼠评价培养细胞的致瘤性。
（2）植入部位 ，例如，将瘤细胞接种到小鼠 躯干接近头部位置的皮下，生瘤的阳性率及 生长的速度比植到尾部高2－4倍。
（3）植入部位微环境的潜在因素，某些细胞 只有在植入部位找到最佳的微环境时才形成 肿瘤。
生瘤性与细胞其它性质的关系
细胞在基质上铺展的面积与生瘤性有关。 微丝束的结构破坏。许多生瘤细胞系均有大
肿瘤细胞系的一般生物学性状:
培养细胞的形态和/或超微结构 细胞生长及增殖能力的检测:
细胞生长曲线； 细胞分裂指数； 细胞倍增时间； 细胞周期,DNA合成； 遗传性状检测： 染色体分析:倍体性、染色体众数、核型分析； 同工酶； 集落形成能力；
细胞数 104/ml
图 -1 细胞生长曲线
动物肿瘤移植实验证实，肿瘤结节在新宿主身上多 次传代之后仍具有原来肿瘤的主要特征，包括形态、 生化、抗原及细胞遗传的标志。所有恶性肿瘤的转 移瘤结节的细胞都具有与亲代原发病损类似的形态 学及生物学性质。
培养中的肿瘤细胞特性
1．致瘤性： 培养的肿瘤细胞移植到敏感动物后，可获得 形成肿瘤的能力。证明细胞在体外能经过类 似于体内肿瘤发生过程中出现的变化。
永生化细胞系的鉴定：
除一般生物学性状外
1. 不死性，代次， 2. 细胞特性的改变： 3. 转染基因的鉴定：PCR, Southern blot ,
证实HPV-16/18 DNA 4. 成瘤性实验：免疫缺陷动物皮下细胞移
细胞悬液的制备
要求：5个浓度的细胞悬液分别是： 10000个；8000个；6000个；4000 个；2000个/100ul/孔 每个浓度3个复孔
恶性转化细胞对密度依赖性抑制的敏感性在肿瘤演 化的过程中自动丢失。
3．获得永生性
正常细胞原代培养物经过数次传代就逐渐停止 增殖。在肿瘤性演化过程中，细胞可能获得生长无 限代数的能力。永生性是肿瘤演化的一个特征。
成纤维及上皮细胞的原代培养经过初期的适应 培养条件之后，便进入较稳定的生长时期，生长速 度逐渐下降，进入退化期即衰老期。细胞系的寿命 差别很大，取决于培养细胞来自的动物种属。
丧失生长抑制性
当培养细胞所需任何一种关键性营养物质或生长因子 降到阈值以下时,正常细胞的生长即受到抑制,如异 亮氨酸,磷酸盐,上皮生长因子等。
转化的细胞对一些生长因子需求降低,或失去了对激素 和生长因子的需求，在营养不足的情况下可继续生 长,它们甚至可以杀死一些自身的细胞,以便在不可 能生存的环境下继续生长。或者由于某些转化产生 了生长因子类似物,为自身提供了生长因子。
密度依赖性抑制
正常贴壁性细胞的增殖率,随着每单位基质面积 内的细胞群体的局部密度增加而下降。这一现象称 为密度依赖性抑制(density dependent inhibition) 。或生长接触抑制(contact inhibition of growth),但二者并不等同。当一个对密度依
赖性抑制敏感的培养细胞达到某种密度，即所谓饱和密度时便停 止生长。此时细胞停止增殖，但并不死亡。这种抑制可以由于液 体培养基中的营养物质耗尽,生长抑制物质的累积所引起。
量的微丝束变化，它与形态转化有关。 停泊依赖性与生瘤性联系最密切。
在动物体内不形成肿瘤的细胞系，在半固体 培养基内形成集落的能力也低；与之相反， 而大多数能在动物体内生瘤的细胞系，形成 集落的效率也高。
2．生长参数和细胞行为的变化
丧失停泊依赖性（anchorage dependency）
一般情况下，原代成纤维及上皮细胞悬浮 培养时不能增殖，它们只有铺展在固体基质 上才能增殖。在肿瘤性演化过程中，相当一 部分的细胞群体获得在悬浮状态形成集落的 能力，并不需贴附在基质上。
使用前对细胞的组织特异性进行鉴定
成骨细胞：没有唯一的特异性标志物 需数个指标联合证实
表面标志： 表达ALP。 Gomarri 法
合成Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、骨钙素、骨粘 蛋白、骨桥蛋白等骨基质蛋白。
组织功能： 体外形成矿化结节。 von Kossa染色法
体内成骨。免疫缺陷鼠皮下移植。
破骨细胞：唯一特异性标志物
干细胞表面标志：CD44,STROL 1,MUC18 ,alpha-SM actin
多潜能功能鉴定： 成骨细胞功能： 细胞碱性磷酸酶（ALP）活性检测：采用 Gomarri 法测定细胞内碱性磷酸酶的活性。
细胞体外矿化能力的检测：细胞经矿化诱导
剂处理后，用von Kossa染色法观察细胞在体外 形成矿化物沉积的能力。