第16章+细胞死亡与细胞衰老

核纤层蛋白、中间丝、被切割导致核纤层解体，
肌动蛋白、凝溶胶蛋 细胞核收缩，细胞形态
白(gelsolin)
改变
Caspase激活的DNA 抑制蛋白被切割后激活，
酶
导致核内DNA降解
参与DNA修 复底酶
PARP
被切割后失活，丧失修 复活性，以便DNA降解
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细胞凋亡 过程中 Caspase
级联效应
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限制性内切核酸酶G(endonuclease G, Endo G)也能引发Caspase非依赖性的细胞凋亡。 Endo G属于Mg2+依赖性的核酸酶家族，定 位于线粒体。在线粒体中其功能是负责线 粒体DNA的修复与复制。受到凋亡信号刺 激时，Endo G从线粒体中释放出来进入细 胞核，对核DNA进行切割。在Caspase未被 激活的情况下，产生典型的以核小体为单 位的DNA片段。
◆ Apaf-1的N端具有Caspase募集结构域(CARD)，它 与细胞色素c结合后发生自身聚合，并进一步通过 CARD结构域招募细胞质中的Caspase-9酶原，形成 大的凋亡复合体(apoptosome)。Caspase-9酶原在凋 亡复合体中发生自身切割而活化，活化的Caspase-9 再进一步激活执行者Caspase-3和Caspase-7酶原，引 起细胞凋亡。
◆ Caspase-8还通过切割Bcl-2家族成员Bid将凋亡 信号传递给线粒体，引发凋亡的内源途径，使凋 亡信号进一步扩大。
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DISC：死亡诱导 信号复合物
细胞凋亡外源和内源信号途径 41
B. 线粒体起始的内源性细胞凋亡
◆ 当细胞受到内部或外部的死亡信号刺激时，细胞色 素c从线粒体释放到胞质作为通路的起始，释放的细 胞色素c与胞质中的Apaf-1(apoptosis protease activating factor) 结合。
第16章
细胞死亡与细胞衰老
1
衰老
机体结构
细胞增殖
细胞分化
细胞凋亡
细胞信号转导
染色体
（DNA与蛋白质的相互作用） 2
第一节 细胞死亡 第二节 细胞衰老
3
第一节 细胞死亡
一、细胞凋亡(apoptosis) 二、细胞坏死(necrosis) 三、细胞自噬(autophagy)
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一、细胞凋亡
• 细胞凋亡 (apoptosis)：主动性细胞死亡， 由基因控制的自杀性程序死亡过程，是程 序性细胞死亡 (programmed cell death， PCD)的主要方式。凋亡需要ATP提供能 量，是一个耗能过程。
所有动物细胞具有类似的凋亡机制，主 要分为caspase依赖途径和caspase非依赖 途径。细胞受到凋亡信号的刺激时，一 般两条途径同时启动。
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1. 胱天蛋白酶(caspase)
◆胱天蛋白酶 (caspase) 为一类天冬氨酸特异性的 含半胱氨酸蛋白水解酶，其活性中心为半胱氨 酸残基，水解底物的位点为天冬氨酸残基后的 肽键，即Asp-X；
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抑制凋亡
Bak
促进凋亡
线
细 胞 凋 亡 途 径
粒 体 起 始 的 内 源
性
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CARD
细胞凋亡外源和内源信号途径 47
3. Caspase非依赖性的细胞凋亡
线粒体能够向细胞质内释放多个凋亡相关 的因子，引发Caspase非依赖性细胞凋亡。
凋亡诱导因子(apoptosis inducing factor, AIF)是克隆的第一个能诱导Caspase非依 赖性细胞凋亡的因子，它定位于线粒体外 膜。在凋亡过程中，AIF从线粒体转移到 细胞质，进而进入细胞核，引起核内DNA 凝集并断裂形成50kb大小的片段，而非 200bp的片断。
• 流式细胞分析：由于细胞凋亡过程
中发生DNA的断裂和丢失，细胞内 DNA含量为亚二倍体状态，用荧光 染料PI染色后在流式细胞仪上可检 测出凋亡的亚二倍体细胞。
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流式细胞分析细胞凋亡
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检测细胞膜成分变化：细胞
凋亡早期，位于细胞膜内侧的 PS翻转到外小叶，可用针对PS 的荧光标记探针进行检测。如 钙依赖性的磷脂结合蛋白 Annexin V能特异性识别膜外 侧的PS。该方法检测早期凋亡 比TUNEL更加灵敏。
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（抑制细胞凋亡）
（促进细胞凋亡）
（促进细胞凋亡）
Bcl-2家族成员结构示意图
wk.baidu.com44
◆细胞接受凋亡信号后，促凋亡因子 Bax和Bak发生寡聚化，从细胞质中转 移到线粒体外膜上，并与膜上的电压 依赖性阴离子通道相互作用，促进cyt c释放从而引起细胞凋亡。凋亡抑制因 子Bcl-2和Bcl-xl能与Bax/Bak形成异二 聚体，通过抑制Bax和Bak的寡聚化来 抑制线粒体膜通道的开启。
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TUNEL测定法检测细胞凋亡
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• 彗星电泳法：单个细胞在琼脂糖凝
胶中，经裂解处理后，再在电场中短 时间电泳，并用荧光染料染色。由于 凋亡细胞DNA的降解片段在电场中泳 动速度较快，使细胞核呈现出彗星式 图形，而正常细胞无DNA断裂，泳动 速度一致保持圆球形。
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彗星电泳法分析细胞凋亡
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◆ 线粒体外膜释放通透性的改变主要受到 Bcl-2(B-cell lymphoma gene 2) 家族的调控。
◆ Bcl-2家族成员可分为3个亚族：Bcl-2亚族，
包括bcl-2、bcl-xl、Bcl-w等可通过抑制线粒
体释放Cyt c，进而抑制细胞凋亡；Bax亚 族，包括Bax、Bak等通过改变线粒体膜透 性促使Cyt c的释放，促进细胞凋亡；BH3 亚族，包括Bad、Bid、Bik等充当细胞内凋 亡信号的“感受器”，促进细胞凋亡。
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Caspase家族成员及其在细胞凋亡 过程中的功能
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◆哺乳动物的Caspase家族分为两类：凋亡起始者： 位于凋亡通路的上游，包括Caspase-2, 8, 9, 10, 11；凋亡执行者：在通路下游起凋亡执行作用， 包括caspase-3, 6, 7等。起始者负责对执行者的 前体进行切割，从而产生有活性的执行者；执 行者负责切割细胞核内、细胞质中的结构蛋白 和调节蛋白。
记法)：末端脱氧核苷酸转移酶介导的 dTUP缺口末端标记测定法(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling)。借助可观测的 标记物(如荧光素)对凋亡细胞的核DNA中 产生的3’-OH末端进行原位标记，用荧光 显微镜进行观察。
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• 细胞凋亡不足会导致包括肿瘤在内的多种 疾病。
• 细胞凋亡过度会导致机体免疫功能的丧失， 或引发自身免疫系统疾病和炎症。如艾滋 病(AIDS)患者表现为过多的淋巴、非淋巴 细胞凋亡，免疫力低下。心肌梗塞、帕金 森综合症等都与细胞凋亡过度有关。
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细胞凋亡在小鼠脚趾形成中的作用
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蝌蚪变态反应中细胞凋亡的作用
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◆细胞内Caspase的活化有两种形式：同性 活化与异性活化。起始Caspase的活化属 于同性活化，当酶原分子聚集成复合物达 到一定浓度时，彼此切割或者构象改变产 生有活性的二聚体形式。执行Caspase的 活化属于异性活化，起始Caspase招募执 行Caspase酶原分子后，对其进行切割， 产生具有活性的执行Caspase。
• 动物细胞凋亡经历：凋亡的起始、凋亡小 体形成、凋亡小体被吞噬和消化几个连续 过程。
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(一) 细胞调亡的特征
凋亡的起始
凋亡小体形成
吞噬和消化
动物细胞凋亡的过程
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(二) 细胞凋亡的检测方法
形态学观测：利用DAPI(4’,6-二眯基-2-
苯基吲哚)与DNA特异性结合或Giemsa使 染色质着色，在荧光显微镜或普通光学 显微镜下观察染色质固缩、趋边、凋亡 小体的形成等凋亡过程。也可在电镜下 观察到染色质固缩、凋亡小体的形成、 细胞发泡等现象。
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◆活化的起始Caspase招募执行Caspase酶原 分子后，对其进行切割，使其产生具有活 性的执行Caspase，进而切割细胞内重要 的结构蛋白和功能蛋白，导致细胞凋亡。
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执行Caspase的底物举例
类别
代表性蛋白
作用
蛋白激酶
细胞支架蛋 白
核酸内切酶
FAK、PKB、 PKC、RAF1
FAK失活破坏细胞黏着， 导致凋亡细胞与邻近细 胞脱离
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英国人悉尼·布雷诺尔 (左)、美国人罗伯特·霍维茨 (中) 和英国人约翰·苏尔斯顿 (右) ，因在器官发育与细胞程序性 死亡方面的贡献而荣获2002年诺贝尔生理学或医学奖。
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1090 –131= 959 (cells)
秀丽隐杆线虫
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诱导细胞凋亡的因子大致可分为两大类： ①物理性因子，包括射线、温度刺激等。 ②化学及生物因子，包括活性氧基团和 分子、钙离子载体、视黄酸、细胞毒素、 影响DNA和蛋白质合成的抑制剂、细胞 凋亡因子(TNF)等。
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◆配体与受体结合，受体构象改变发生聚合，聚合 的Fas受体通过胞内死亡结构域 (DD) 招募同样具 有死亡结构域的接头蛋白FADD和Caspase-8酶原， 形成死亡诱导信号复合物DISC(death inducing signaling complex)。Caspase-8酶原在复合物中 通过自身切割而被激活，进而切割执行者 Caspase-3酶原，产生有活性的Caspase-3，导致 细胞凋亡。
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(三) 细胞调亡的生理意义
动物机体靠对细胞增殖和细胞周期的正负控制 以及对程序性细胞死亡的正负控制来维持细胞 总数的平衡和机体的生命活力。
胚胎发育过程中，器官的形成以及形态构建存 在细胞的凋亡。如指和趾的形成、无尾两栖类 尾的退化、神经元细胞数量的维持等。
成体中通过细胞凋亡清除不再需要的细胞、部 分被病毒感染的细胞、某些肿瘤细胞和衰老的 细胞等，而不引起炎症反应。
◆细胞凋亡过程可分为激活期(activation phase)和执
行期(execution phase)两个阶段。激活期细胞应答 死亡信号，起始Caspase活化；执行期执行 Caspase活化，执行细胞死亡程序。
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◆ 无论是起始Caspase还是执行Caspase，其 前体匀以无活性的Caspase酶原存在于细 胞中。 Caspase酶原具有N端的前结构域、 大亚基区域、小亚基区域以及大小亚基区 域间的连接区域。当酶原被活化时，各个 结构域之间发生裂解，两个大亚基和两个 小亚基的区域形成四聚体复合物。
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细胞凋亡对发育中神经细胞
数量的调节
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(四) 细胞凋亡的分子机制
2002年生理学或医学奖授予在器官发育和 细胞凋亡中做出杰出贡献的三位科学家。
1. 胱天蛋白酶(Caspase) 2. Caspase依赖性的细胞凋亡 3. Caspase非依赖性的细胞凋亡 4. 穿孔蛋白-颗粒酶介导的细胞凋亡 5. 细胞凋亡的调节
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起始Caspase 的同性活化
。
执行Caspase 的异性活化
Caspase酶原的活化
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◆起始Caspase-8、10含有串联重复的死亡 效应结构域(death effector domain, DED)； 而 起 始 Caspase-2 和 9 含 有 Caspase 募 集 结 构域(Caspase reruitment domain, CARD)。 通过DED或CARD结构域间的聚合，起始 Caspase 可 彼 此 结 合 或 与 接 头 蛋 白 结 合 ， 被募集到上游信号复合物中发生同性活化。
2. Caspase依赖性的细胞凋亡途径 Caspase依赖性的细胞凋亡
主要通过两条途径引发：细胞表 面死亡受体起始的外源途径和线 粒体起始的内源途径。
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A. 细胞表面死亡受体介导的 外源性细胞凋亡
◆死亡受体介导的细胞凋亡起始于死亡配体 与受体的结合。死亡配体主要是肿瘤坏死 因子 (TNF) 超家族成员；死亡受体为跨膜 蛋白，TNF-R1和Fas(Apo-1, CD95)是死亡 受体家族的代表成员，其胞外具有半胱氨 酸富集的重复区，胞内具有死亡结构域 (death domain，DD)。
◆Caspase最早在秀丽隐杆线虫中发现， ced-3 和 ced-4是细胞凋亡的必需基因，而ced-9可抵消 ced-3和ced-4 的作用，防止细胞凋亡，因此ced9抑制细胞凋亡;
◆ Ced3在哺乳动物细胞中的同源蛋白是白介素-1 转换酶(ICE)。ICE后被命名为Caspase-1，它催 化白介素-1前体的剪切成熟。
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细胞凋亡的荧光显微镜观察
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• DNA电泳：细胞凋亡时，染色质
DNA在核小体间被特异性切割，DNA 降解成180～200bp或其整倍片段。提 取凋亡细胞DNA进行电泳，可出现 200bp DNA梯状条带。DNA ladder仍 然是鉴定细胞凋亡最简便可靠的方法。
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• TUNEL测定法(DNA断裂的原位末端标