共聚焦激光扫描荧光显微镜-基本原理、应用及样本制备原则

若须快速测量
KCL
KCL
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双光子激光扫描荧光显微系统
• 照射光波长大于荧光 染料吸收峰波长2倍 • 高能量(2KW)、超短 脉冲(兆分之一秒)聚焦, 使聚焦点瞬间产生高密 度光子, 出现双光子吸收 激发荧光 • 双光子吸收仅发生在 聚焦点, 避免了焦点外激 发而产生的漂白现象 •高能量、超短脉冲聚焦 、穿透性更强 50 µm 500 µm
荧光探针 激发波长 发射波长
Kd 390nM 190nM 550nM 140nM 20,000nM
FLuo3-AM, Calcium Green-1 Calcium Green-2 Fura red Oregon Green 488
464nm 507nm 507nm 420/480nm 494nm
526nm 530nm 535nm 637nm 520nm
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2. 荧光探针的选择
原则：尽量减小不同荧光物质间激发/发射光谱的重叠。
标记要求
∆
荧光素选择/组合
无特殊限制。 ∆ FITC, Cy2最佳；尽量不选择Cy5, Cy5.5（红外) ∆ 与自发荧光冲突时，采用Texas Red 。 FITC/Cy2+TEXAS RED FITC/Cy2+RHODAMINE/Cy3 (必须顺序扫描) FITC/Cy2 + TEXAS RED + Cy5.5 FITC/Cy2 + RHODAMINE/Cy3 + Cy5.5 (必须顺序扫
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KCL诱导的细胞外Ca++内流测量
培养/分离的细胞 → 20µM Fluo 3-AM负载液30-60min → 清洗、换液 → 扫描 1.改变扫描速度 2.采用双向扫描 3.减少采样点数(牺牲空间分辨率） 4.采用线扫描(xt)
EXCITATION Cy2 Cy3 FITC
Rhodamine
INTENSITY [arb. units]
Texas Red
Cy5 Cy5.5
EMISSION
400
450
500
550
600
650
700
750
800
WAVELENGTH [nm]
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3. 绿色荧光蛋白（GFP）
GFP的发现：60年代，Shimomura等首先从水母中分离出一种水母发 光蛋白 (aequoren)，该蛋白与钙和肠腔素结合后可产生蓝色荧光。然而水 母整体提取的颗粒都呈绿色，后经证实在水母体内还存在另外一种发光蛋 白即绿色荧光蛋白（ green fluorescent protein GFP）。
FITC
488nm
520nm
976nm
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共聚焦激光扫描荧光显微镜术样本制备的基本原则
1.常用荧光素的特性
EXCITATION and EMISSION SPECTRA
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4. 活细胞内离子动态变化测量
细胞内游离Ca2+测量
原理: 检测游离Ca2+变化的荧光探针多为Ca2+螯合剂，通常不能透过细 胞膜，只有与乙酰甲酯(AM)相连方可进入细胞内, 被细胞内酯酶水解后 方能与胞内游离钙结合后发出荧光。 Kd值：为Ca2+解离常数，指示检测Ca2+浓度的范围: 0.1xKd-10xkd —和很多因素有关（pH、 Mg2+、温度、与蛋白的结合、等） 细胞内生理Ca2+浓度值：10-100nM 细胞内Ca2+超载浓度值：基础Ca2+浓度的10倍左右
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武汉大学医学院结构生物学研究中心
Centre for Structural Biology Wuhan University School of Medicine
共聚焦激光扫描荧光显微镜
— 基本原理、应用及样本制备原则
宋 健
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检测 以供体的激发波长的光照射样品,没有共 振转移时，只检测到供体的荧光，发生共振 转移时，供体的荧光减弱，受体被激发出现 荧光。 应用 ∆ 受体与配体的相互作用：亚基的结合 与分离 ∆ 大分子构象的改变
Ligand
Fluorescence Intensity
Cy5 Cy3
Time
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激发滤镜：从光源中分滤出一定波长范围的激发光。
带通滤色镜(BP)：有宽、窄带之分。如：BP450-490 长、短通滤色镜组合（LP + KP）：LP450 + KP490
488nm 520nm
双色镜：双色分光镜；反射短波长，透过长波长。 阻断滤镜：多为长通滤色镜；LP490
450nm 490nm
FITC
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2 . 荧 光 能 量 共 振 转 移 ( Fluorescence Resonance Energy Transfer)
I.荧光能量共振转移: 受激态荧光素将其能量向另一个荧光素传递，使
后者被激发，这一过程称荧光能量共振转移。能量的提供者叫供体荧光 素，能量的接受者叫受体荧光素。
II.荧光能量共振转移的条件
1.供体与受体间的距离 <10nm或=1-7nm 2.供体的发射光谱与受体的吸收光谱 有实质性的重叠
供体荧光素 受体荧光素
488nm
520nm
540nm
650nm
供体荧光素 (Cy2)
488nm 520nm
受体荧光素 (Cy3)
650nm
供体荧光素 (Cy2)
受体荧光素 (Cy3)
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III. 常用荧光共振转移探针对
FITC/TRITC, Cy3/Cy5, BFP/GFP
共聚焦系统 细胞CT
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荧光和荧光显微镜
一、荧光的基础术语
荧光物质： 某些物质在特定波长范围内的光线照射下，可发 出波长比照射光长的光线 — 荧光。受激发后能 产生荧光的物质称荧光物质或荧光素 激发光(EXCITATION)： 能特异性地激发某种荧光素的一定波长范围内的 光线称为该荧光素的激发光。激发/吸收光谱；吸 收波峰(最大吸收波长) 发射光(EMISSION): 异硫氰酸荧光素(FITC) 发射光谱；发射波峰(最大发射波长) 荧光探针： 能产生荧光的特异性生物染料（PI, Dapi)、标有荧光素的特异性蛋白结合物（荧光抗体） 自发荧光(AUTOFLUORESCENCE): 组织或细胞中的某些成份受激发时可发出荧光—自发荧光。 伊文斯蓝、硼化氢钠处理 漂白(BLEACH)： 荧光物质受激发时，其发射荧光的能力逐渐下降并最终丧失 — 漂白。
光电倍增管
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共聚焦扫描显微镜光学原理
检测针孔和光源针孔始终聚焦于同一 点，使聚焦平面以外被激发的荧光不能进 入检测针孔 高分辨率的光学切片
检测针孔 光源针孔
光源
分色镜
激光穿透性强，可对样本进行一定深 度光学断层，获得高标准的连续光学切片 实现三维重建
物镜
488nm 520nm
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荧光显微镜
二、荧光显微镜术的基本原理
高 压 汞 灯
滤镜 分光
被荧光 紫外 激发 探针染 蓝 色的生 绿 物样本
光学 成像
被标记 结构的 荧光光 学图像
Laser and electronic Control Unit
激光光源及 控制装置
Antivibration table 防震台
Leica TCS SP-2 MP AOBS Confocal System
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1. 荧光漂白恢复 (Fluorescence Recover after photobleaching; FRAP) 检测细胞连接间的信息传递
Intensity Before bleach After bleach 90 min after bleach
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光电倍增管
检测 针孔 共聚焦装置
光源 针孔
X/Y扫描 装置
荧光显微镜 步进聚焦电机
物镜
Bio-Rad LaserSharp
系统操作，图像处理 3-D重建
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三维胶原基 质培养的血 管平滑肌细 胞
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共聚焦激光扫描荧光显微镜应用领域
只要目的结构是用荧光探针标记的，都可 用共聚焦激光扫描荧光显微镜观察。 形态学研究：细胞凋亡、中枢神经系的F联 系、肿瘤细胞分类…… 分子生物学：原位杂交，DNA、RNA定量， DNA损伤修复、外源性基因在真核细胞的表达、 定位，荧光能量共振转移→大分子构象的改变 、受体与配体相互作用…… 活细胞动态荧光测量：细胞内Ca++、K+、H+ 等离子的动态分布及动态定量、荧光漂白恢复 →细胞连接间的信息沟通…… 直接对活组织或整体胚胎观察：单光子共 聚焦激光扫描系统的局限性：荧光漂白
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什么是共聚焦激光扫描荧光显微镜？
共聚焦激光扫描荧光显微镜（Confocal Laser Scanning
Fluorescence Microscope；LSFM）
以激光作为激发光源，采用光源针孔与检测针孔共轭 聚焦技术，对样本进行断层扫描，以获得高分辨率光学切片的 荧光显微镜系统
聚集平面
样本
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Aequoren +
Ca2+ 肠腔素
蓝色荧光
GFP
绿色荧光
GFP, CFP, BFP, YFP商品化质粒 1. 转基因动物: Green mouse 2. 外源基因的报告基因: 将外源基因与GFP DNA 相连, 可实时监 测外源基因的表达. 3. 检测细胞能否表达某一基因: 将待测基因的启动子与GFP DNA 相连, 可实时监测细胞能否表达兴趣基因. 4. GFP-蛋白融合技术: 将结构蛋白基因与GFP DNA 相连可实时监 测结构蛋白的表达→亚细胞结构的形成
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共聚焦激光扫描荧光显微镜基本配置
Confocal scan and detector unit 共聚焦扫描及检测装置 Computer
计算机
Microscope 荧光显微镜