工程菌发酵生产色氨酸

工程菌发酵生产色氨酸
一、实验目的
1．了解以细菌（大肠杆菌）为产生菌，获得初级代谢产物为目的的液体深层发酵方法。

2．学习细菌发酵生产氨基酸过程中的菌体生长的规律以及发酵产酸的规律。

3．了解发酵液中色氨酸含量的检测方法。

二、实验原理
L－色氨酸化学名称为L-氨基吲哚基丙酸，分子式：C11H12N2O2，分子量：204.23，它是含有吲哚基的中性芳香族氨基酸。

O
OH
NH2
NH
色氨酸的化学结构式
L-色氨酸是人体和动物生命活动中八种必需氨基酸之一，对人和动物的生长发育、新陈代谢起着重要的作用，被称为第二必需氨基酸，广泛应用于医药、食品和饲料等方面。

L-色氨酸的生产最早主要是依靠化学合成法和蛋白质水解法制造。

随着色氨酸市场的开拓，微生物法生产色氨酸的方法现已走向实用并且处于主导地位。

微生物法大体上可以分为直接发酵法、微生物转化法和酶法。

直接发酵法是以葡萄糖、甘蔗糖蜜等廉价原料为碳源，利用优良的色氨酸产生菌来生产色氨酸。

由于色氨酸合成的多重反馈抑制机制及弱化子调节机制，加上整个芳香族氨基酸代谢流在生物体内本来就较弱，使得该法在相当长的一段时间内达不到工业化生产的要求。

随着重组DNA技术在微生物育种中的应用，为优良的色氨酸生产菌株的筛选和产酸水平的提高提供了可靠的技术保障，使微生物直接发酵法生产色氨酸成为一种廉价的工业化生产方法。

微生物转化法是使用葡萄糖作为碳源，同时添加合成色氨酸所需的前体物（如邻氨基苯甲酸、吲哚、L-丝氨酸等），利用微生物
的色氨酸合成酶系转化前体来合成色氨酸。

酶法是利用微生物中色氨酸生物合成酶系的催化功能生产色氨酸。

这些酶包括色氨酸酶、色氨酸合成酶、丝氨酸消旋酶等。

酶法一般由酶源菌体的培养、菌体的分离洗涤、固定化和催化反应等几个阶段组成。

酶法能够利用化工合成的前体物为原料，既充分发挥了有机合成技术的优势，又具有产物浓度高、收率高、纯度高、副产物少、精制操作容易的优点，是一种成本较低的工业化生产色氨酸的方法。

氨基酸的直接发酵生产多以细菌发酵为主，本实验选用谷氨酸棒杆菌来发酵生产色氨酸。

三、实验仪器与材料
（一）仪器
10L发酵罐、恒温摇床、超净工作台、显微镜、数字可调移液器、高压灭菌锅、721分光光度计、电炉、恒温培养箱、碱式滴定管、酸式滴定管、三角瓶（250ml）、试管（18×180mm）。

（二）材料
大肠杆菌(Escherichia coli) 实验室提供。

蛋白胨、葡萄糖、蔗糖、牛肉膏、酵母膏、玉米浆、硫酸铵、硫酸镁、L-酪氨酸、L-苯丙氨酸、生物素、硫胺素。

（三）试剂
1、菌种保藏斜面培养基：0.3%NaCl，0.5% 酵母膏，0.7%牛肉膏，1% 蛋白胨，2%
琼脂，pH 7.0
2、平板活化培养基：0.3%NaCl，0.5% 酵母膏，0.7%牛肉膏，1% 蛋白胨，2% 琼脂，
1%葡萄糖，pH 7.0
3、种子培养基（g/L)：每升含葡萄糖20g，酵母浸出粉5.0，KH2PO4 11.5g，MgSO4.7H2O
3.0g，(NH4)2SO4 6.0g，硫酸亚铁66mg，柠檬酸三钠二水物3.0，pH 7.0-7.2，115℃，
15min
4．发酵培养基（g/L)：每升含葡萄糖20g，酵母浸出粉1.0，硫酸铵4.0，柠檬酸三钠二水物2.0，硫酸镁3.0,磷酸二氢钾2.0‘硫酸亚铁100mg；pH7.0-7.2,115℃,115min 5.0.2% 蒽酮试剂
准确称取0.2g 蒽酮溶于100 mL浓硫酸中，并于棕色瓶冷暗处保存，现配现用。

6.0.5% 亚硝酸钠溶液
准确称取0.5 g亚硝酸钠溶于蒸馏水中，定容至100 mL，新鲜配制。

7.50% 硫酸储备液
将500 mL浓硫酸小心的加入到500 mL蒸馏水中，边加边搅拌，最终定容至1000 mL，配成9 mol/L的硫酸储备液。

8.3.0 g/L对二甲氨基苯甲醛储备液
准确称取1.5 g对二甲胺基苯甲醛溶于500 mL 50%的硫酸溶液中，移至500 mL容量瓶中，以50%的硫酸溶液定容至刻度。

四、实验步骤
（一）培养基：
1、摇瓶种子培养基（g/L）
每升含葡萄糖20g，酵母浸出粉5.0，KH2PO4 11.5g，MgSO4.7H2O 3.0g，(NH4)2SO4 6.0g，硫酸亚铁66mg，柠檬酸三钠二水物3.0，pH 7.0-7.2，115℃，15min。

2、发酵培养基（g/L）
每升含葡萄糖20g，酵母浸出粉1.0，硫酸铵4.0，柠檬酸三钠二水物2.0，硫酸镁3.0,磷酸二氢钾2.0‘硫酸亚铁100mg；pH7.0-7.2,115℃,15min培养条件
二．种子培养方法
1、种子活化培养：
于超净工作台面上，在火焰保护下，将斜面保藏的菌种接到活化斜面上置35℃培养箱中（斜面朝下放）培养1-2天(LB固体培养基）。

2、摇瓶种子培养：
从生长良好的活化斜面接一环菌苔至装有20 mL种子培养基的250 mL三角瓶中，置回转式摇床上，于240 r/min，35℃振荡培养至对数生长中后期。

3、发酵罐培养工艺：
10L发酵罐基础料配料体积5L，消后体积5L，接种量200mL。

培养12h以后补加2L发酵液（已灭菌），初始通气量4 L/min;搅拌转速200 r/min;培养温度35.5℃；以泡敌消泡；发酵过程中，通过自动流加氨水控制pH为7.0；当溶氧降至50%以下时，增加通气量到8 L/min；同时搅拌转速提升至250~300 r/min；当培养液中葡萄糖浓度下降至一定值时，把80%（1600g葡萄糖+蒸馏水定容至2L）的葡萄糖溶液以一定的流加速度加至培养液中，以维持发酵时葡萄糖浓度在所需范围之内。

三、发酵期间操作要求：
1、种子：并瓶前应剔除可疑的种子瓶，对种子液进行镜检（观察菌的形态，有无杂菌等），测pH，菌浓。

对接种后残留的种子液进行无菌观察。

2、在发酵过程中，每8小时取样，做以下工作：镜检（观察菌的形态、有无杂菌），测
培养液pH，测培养液总糖及氨基氮，测生物量和色氨酸含量，并做好记录。

3、每0.5小时观察并做一次记录：罐温，罐压，搅拌速度，pＨ，溶氧。

（四）pH电极的标定
1.准备小烧杯两只，大烧杯一只，洗瓶一个(内装蒸馏水)，pH标准缓冲溶液：
pH6.86，4.00或9.18，吸水纸若干；
2.接通设备电源，预热5分钟以上；
3.标定：pH标定两个点，先确定发酵过程中pH值是≥7还是≤7，若≥7，则用
pH6.86和pH9.18的标准溶液来标定电极；若≤7，则用pH6.86和pH4.003标准溶液来标定电极；
4.标定一次，可连续使用2-3次，若停用时间较长，则使用前必须标定。

（五）DO电极的标定
接通设备电源，预热5分钟以上。

取适量的无水亚硫酸钠，放入三角烧瓶内，并放入适当200mL左右的自来水，摇动几下，保证为饱和溶液状态。

将DO电极放入烧瓶内，稍后可见DO值下降，待5-10分钟后，将其值设为0。

将电极取出，放入发酵罐内，在接种之前，发酵罐在大量充气后进行搅拌，在操作温度下，将DO值设为100%。

（六）发酵罐灭菌操作
1.灭菌前的准备工作：主要包括，罐体清洗，校正pH电极，标定DO电极的
零点。

严密度检查（试压），将培养基倒入发酵罐中，盖好罐盖。

将电极分别插入罐盖上对应的孔中，并旋紧压盖。

将控制pH用的酸碱液、消泡剂及其它物料分别放入盐水瓶中（装料总量不得大于总容积的80％），并连接好补液管和微孔过滤器。

关闭所有管路阀门，在触摸屏上开启灭菌模式，开启蒸汽发生器，压力升至0.3 MPa。

灭菌过程应采用饱和蒸汽（总蒸汽压力不低于0.3MPa～0.35MPa，使用压力不低于0.2MPa）；
2.灭菌开始：先用蒸汽冲洗各管路，打开排气阀门，打开罐体夹套蒸汽管路相
关阀门，将蒸汽引入夹套预热，当罐内温度升至100℃时，关小排气，开启直接进罐蒸汽；
3.罐内进汽：关闭夹套进蒸汽阀门，打开直接进罐蒸汽阀门，蒸汽进罐内，使
罐内升温至121℃，打开空气管路蒸汽阀门，对空气过滤器进行灭菌，调整直接进罐蒸汽阀门、空气管路蒸汽阀门以及排气阀，使罐内保持0.12MPa，121℃灭菌30分钟（该过程应注意观察液体的翻动情况，进、排气情况，如是否通畅、排气是否过大）；
4.灭菌结束：关闭所有蒸汽阀门，打开排气阀，罐压下降至0.01MPa，打开空
气管路相关阀门，引入无菌空气保压（只有在罐内压力小于过滤器空气压力时才可开启空气进罐阀门，防止料液倒压至过滤器），罐压维持在
0.03-0.05MPa；
5.发酵开始：打开自来水阀门，进入快速降温模式，降至发酵所需设定温度，
退出快速降温模式，在触摸屏开启发酵模式，进入保温运行；
6.接种发酵：采用火焰法接种后，根据工艺要求，调整进排气阀门，空气流
量，保持罐压至发酵结束。

（八）中间操作要求
1.种子：移种前需镜检（观察菌的形态，有无杂菌）；
2.发酵过程中，每8小时取样，做以下分析测定工作：镜检（观察菌的形态、有无杂
菌），测培养液pH，测培养液总糖及氨基氮，测生物量和色氨酸含量，并做好记录；
3.取样的操作要求：
取样管一般安装在罐的侧部或顶部，取样频率可根据实验要求及培养物的体积而定。

一般总取样量不应超过发酵液体积的10%，否则诸如氧传递速率等会受影响。

1)取样前对其取样管道进行消毒。

适当打开取样管冷凝水阀，全开取样管
蒸汽阀，微开冷凝水阀，保持一定的活蒸汽消毒（每次取样前或取样后，
至少需要蒸汽灭菌5min）；
2)取样操作，关闭取样管冷凝水阀，关闭取样管蒸汽阀，适当开大取样管
冷凝水阀，打开取样阀，使培养基缓缓流出；
3) 取样结束后关闭取样阀，关闭取样管冷凝阀，开大取样管蒸汽阀，微开
取样管冷凝水阀，保持一定活蒸汽灭菌。

4. 色氨酸产生菌发酵过程中生物量的测定方法
将每隔8h 取的发酵液稀释50倍，以未接种的发酵培养基做空白，用分光光度计在620nm ，1cm 光程下测量OD 值。

以时间为横坐标，OD 为纵坐标绘制菌体生长曲线。

标准曲线的绘制，取约100mL 的培养细胞悬浊液，约20mL 用于测定浊度，其余用于测干重求出细胞浓度。

原液的吸光度在0.3以下时应离心分离，将细胞浓缩。

用缓冲液或原液离心后的上清液等稀释至原液，原液×0.8，原液×0.6，…，原液×0.2，原液×0.1。

由OD 及细胞浓度的测定结果绘制标准曲线。

吸光度在0.05～0.3的范围内，吸光度与细胞浓度呈线性关系。

5． 每0.5h 观察并做一次记录：罐温，罐压，搅拌速度，pH 。

6． 发酵液中色氨酸含量的测定方法
取发酵液1mL 加蒸馏水定容至50mL （稀释50倍）。

取两支18×180mm 试管，分别加入稀释50倍后的发酵液各1mL ，之后，一支加入对二甲氨基苯甲醛储备液9mL ，另一支加1︰1硫酸储备液（即表示浓硫酸和水比例为1︰1）9mL （做空白），摇匀后，共同放入沸水浴中加热4min ，取出，各加入2%的亚硝酸钠溶液各1滴，摇匀后，继续加热3min ，取出，冷水浴冷却。

用1cm 比色皿在595nm 处测定吸光值A 。

代入公式，计算色氨酸含量C 。

色氨酸标准工作曲线
色氨酸检测标准曲线
A = 0.0041C - 0.0208
R 2
= 0.9971
00.10.20.30.40.50.60.70.8
0.90
20
40
6080100120140160180200220
色氨酸浓度C(mg/L)
吸光度A /595n m
7. 葡萄糖标准曲线的绘制
发酵液中糖含量的分析—蒽酮比色法[95]
原理:硫酸可使糖类脱水生成糠醛，生成的糠醛或羟甲基糠醛与蒽酮脱水缩合，形成糠醛的衍生物，呈蓝绿色，该物质于620nm 处有最大吸收。

取葡萄糖标准溶液，适当稀释配制成10、20、30、40、60、80 mg/L 系列标准溶液，取各稀释液1 mL 加蒽酮试剂4 mL ，摇匀，迅速浸于冰水浴中冷却，浸入沸水浴中自重新煮沸起，准确煮沸10 min 取出，用流水冷却，室温放置10 min ，用1 cm 比色皿在620 nm 处测定吸光值。

以吸光度为纵坐标，葡萄糖浓度（mg/L ）为横坐标绘制L-色氨酸标准曲线，得出线性回归方程及相关系数。

8.发酵液中葡萄糖的定量测定
将发酵液稀释40倍，按照所述方法，做5个平行实验，在620 nm 波长下测定其吸光度，计算出发酵液中的糖含量.取1mL 已处理好的样液，加蒽酮试剂4mL ，摇匀，迅速浸于冰水浴中冷却，浸入沸水浴中自重新煮沸起，准确煮沸10 min 取出，用流水冷却，室温放置10 min ，用1 cm 比色皿在620 nm 处测定吸光值。

以标准曲线法定量，求出葡萄糖的含量。

葡萄糖标准曲线的绘制
按照7所述方法绘制葡萄糖标准曲线，结果如图2-1所示。

0.10.20.30.40.50.60.70.80.9
0.02
0.040.060.08
0.1
葡萄糖浓度(g/L)
吸光度A
图2-1 葡萄糖标准曲线
Fig.2-1 Calibration curve for the determination of Glucose
由图2-1可知吸光度A 与葡萄糖浓度之间形成一条良好的线性关系。

线性回归后得到回归方程为A620nm=10.502C+0.0029，相关系数为R 2=0.9994，说明葡萄糖在0.01～0.08 g/L 范围内，吸光度与葡萄糖浓度之间线性回归比较显著。

五、实验结果及分析 （一）测定方法
1． 总糖和还原糖含量测定：费林定糖法（参见实验5） 2． 氨基氮含量测定：甲醛氧化法（参见实验5） 3．
发酵液中色氨酸含量的测定：比色法（参见实验5）
（二）计算 1．发酵产率
发酵产率是指单位操作时间内，单位发酵罐容积生产的目的产物量，有小时产率（又称发酵指数）和年产率两种方法。

发酵指数=发酵时间发酵罐容积目的产物量
⨯[g/(L ·h)]
2．以底物消耗为基准的菌体得率
在发酵培养过程中，某一时间段内，若菌体的浓度变化为△X ，对应的某种营养物质浓度变化为△S ，则菌体关于营养物质的得率Y X/S 为：
Y X/S =－S
X
∆∆
3．比生长速率
反映菌体生长快慢的参数有菌体浓度变化率（d X /dt ）和比生长速率（µ），二者的数学关系如下：
dt
dX=µX
µ =
X dt
/
dX
某一时段内平均比生长速率的近似计算方法为：
μ=
1
21
2
t t X
ln
X
ln
-
-
式中X—发酵液中的菌体浓度，g/L；
d X/dt —菌体浓度变化率，g/(L·h)；µ—比生长速率，h-1；
μ—平均比生长速率，h-1；
X 1，X
2
—分别为对应时刻t
1
和t
2
的菌体浓度。

（三）分析
菌体生长阶段、糖耗与菌体生长及色氨酸合成的关系。

（四）原始记录及批报格式
实验发酵原始记录
培养时间取
样
时
间
罐温
（ºC）
罐压
（MPa）
通气量
（L/min）
转速
（r/min）
pH 菌
浓
总糖
（g/100mL）
氨基氮
（mg/100mL）
细
胞
数
量
无
菌
度
填
表
人
六、注意事项
提前一周将保藏的色氨酸产生菌接至斜面活化，培养成熟置斜面保藏备用。

本实验预计学时数20学时。