工程菌发酵生产色氨酸

工程菌发酵生产色氨酸

一、实验目的

1．了解以细菌（大肠杆菌）为产生菌，获得初级代谢产物为目的的液体深层发酵方法。

2．学习细菌发酵生产氨基酸过程中的菌体生长的规律以及发酵产酸的规律。3．了解发酵液中色氨酸含量的检测方法。

二、实验原理

L－色氨酸化学名称为L-氨基吲哚基丙酸，分子式：C11H12N2O2，分子量：204.23，它是含有吲哚基的中性芳香族氨基酸。

O

OH

NH2

NH

色氨酸的化学结构式

L-色氨酸是人体和动物生命活动中八种必需氨基酸之一，对人和动物的生长发育、新陈代谢起着重要的作用，被称为第二必需氨基酸，广泛应用于医药、食品和饲料等方面。

L-色氨酸的生产最早主要是依靠化学合成法和蛋白质水解法制造。随着色氨酸市场的开拓，微生物法生产色氨酸的方法现已走向实用并且处于主导地位。微生物法大体上可以分为直接发酵法、微生物转化法和酶法。直接发酵法是以葡萄糖、甘蔗糖蜜等廉价原料为碳源，利用优良的色氨酸产生菌来生产色氨酸。由于色氨酸合成的多重反馈抑制机制及弱化子调节机制，加上整个芳香族氨基酸代谢流在生物体内本来就较弱，使得该法在相当长的一段时间内达不到工业化生产的要求。随着重组DNA技术在微生物育种中的应用，为优良的色氨酸生产菌株的筛选和产酸水平的提高提供了可靠的技术保障，使微生物直接发酵法生产色氨酸成为一种廉价的工业化生产方法。微生物转化法是使用葡萄糖作为碳源，同时添加合成色氨酸所需的前体物（如邻氨基苯甲酸、吲哚、L-丝氨酸等），利用微生物

的色氨酸合成酶系转化前体来合成色氨酸。酶法是利用微生物中色氨酸生物合成酶系的催化功能生产色氨酸。这些酶包括色氨酸酶、色氨酸合成酶、丝氨酸消旋酶等。酶法一般由酶源菌体的培养、菌体的分离洗涤、固定化和催化反应等几个阶段组成。酶法能够利用化工合成的前体物为原料，既充分发挥了有机合成技术的优势，又具有产物浓度高、收率高、纯度高、副产物少、精制操作容易的优点，是一种成本较低的工业化生产色氨酸的方法。

氨基酸的直接发酵生产多以细菌发酵为主，本实验选用谷氨酸棒杆菌来发酵生产色氨酸。

三、实验仪器与材料

（一）仪器

10L发酵罐、恒温摇床、超净工作台、显微镜、数字可调移液器、高压灭菌锅、721分光光度计、电炉、恒温培养箱、碱式滴定管、酸式滴定管、三角瓶（250ml）、试管（18×180mm）。

（二）材料

大肠杆菌(Escherichia coli) 实验室提供。

蛋白胨、葡萄糖、蔗糖、牛肉膏、酵母膏、玉米浆、硫酸铵、硫酸镁、L-酪氨酸、L-苯丙氨酸、生物素、硫胺素。

（三）试剂

1、菌种保藏斜面培养基：0.3%NaCl，0.5% 酵母膏，0.7%牛肉膏，1% 蛋白胨，2%

琼脂，pH 7.0

2、平板活化培养基：0.3%NaCl，0.5% 酵母膏，0.7%牛肉膏，1% 蛋白胨，2% 琼脂，

1%葡萄糖，pH 7.0

3、种子培养基（g/L)：每升含葡萄糖20g，酵母浸出粉5.0，KH2PO4 11.5g，MgSO4.7H2O

3.0g，(NH4)2SO4 6.0g，硫酸亚铁66mg，柠檬酸三钠二水物3.0，pH 7.0-7.2，115℃，

15min

4．发酵培养基（g/L)：每升含葡萄糖20g，酵母浸出粉1.0，硫酸铵4.0，柠檬酸三钠二水物2.0，硫酸镁3.0,磷酸二氢钾2.0‘硫酸亚铁100mg；pH7.0-7.2,115℃,115min 5.0.2% 蒽酮试剂

准确称取0.2g 蒽酮溶于100 mL浓硫酸中，并于棕色瓶冷暗处保存，现配现用。

6.0.5% 亚硝酸钠溶液

准确称取0.5 g亚硝酸钠溶于蒸馏水中，定容至100 mL，新鲜配制。

7.50% 硫酸储备液

将500 mL浓硫酸小心的加入到500 mL蒸馏水中，边加边搅拌，最终定容至1000 mL，配成9 mol/L的硫酸储备液。

8.3.0 g/L对二甲氨基苯甲醛储备液

准确称取1.5 g对二甲胺基苯甲醛溶于500 mL 50%的硫酸溶液中，移至500 mL容量瓶中，以50%的硫酸溶液定容至刻度。

四、实验步骤

（一）培养基：

1、摇瓶种子培养基（g/L）

每升含葡萄糖20g，酵母浸出粉5.0，KH2PO4 11.5g，MgSO4.7H2O 3.0g，(NH4)2SO4 6.0g，硫酸亚铁66mg，柠檬酸三钠二水物3.0，pH 7.0-7.2，115℃，15min。

2、发酵培养基（g/L）

每升含葡萄糖20g，酵母浸出粉1.0，硫酸铵4.0，柠檬酸三钠二水物2.0，硫酸镁3.0,磷酸二氢钾2.0‘硫酸亚铁100mg；pH7.0-7.2,115℃,15min培养条件

二．种子培养方法

1、种子活化培养：

于超净工作台面上，在火焰保护下，将斜面保藏的菌种接到活化斜面上置35℃培养箱中（斜面朝下放）培养1-2天(LB固体培养基）。

2、摇瓶种子培养：

从生长良好的活化斜面接一环菌苔至装有20 mL种子培养基的250 mL三角瓶中，置回转式摇床上，于240 r/min，35℃振荡培养至对数生长中后期。

3、发酵罐培养工艺：

10L发酵罐基础料配料体积5L，消后体积5L，接种量200mL。培养12h以后补加2L发酵液（已灭菌），初始通气量4 L/min;搅拌转速200 r/min;培养温度35.5℃；以泡敌消泡；发酵过程中，通过自动流加氨水控制pH为7.0；当溶氧降至50%以下时，增加通气量到8 L/min；同时搅拌转速提升至250~300 r/min；当培养液中葡萄糖浓度下降至一定值时，把80%（1600g葡萄糖+蒸馏水定容至2L）的葡萄糖溶液以一定的流加速度加至培养液中，以维持发酵时葡萄糖浓度在所需范围之内。