液相色谱柱基础知识

球形（Spherical）
– 目前流行的分析填料 – 更好的性能，重现性
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对色谱柱填料的了解(二)
键合相化学 –影响化合物的分离度：α –不同键合相对不同种类的化合物分离不同 –可能导致色谱的分离机理不同 –如：C18、C8、CN
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对色谱柱填料的了解(六)
硅胶的活性 –主要影响碱性化合物的保留行为：k' –生产硅胶时处理温度不同，硅胶活性也不同 –是选择性差异的主要来源 硅胶的杂质含量 –重金属含量低，硅羟基活性小，拖尾减小 –是色谱柱质量好坏的重要标志
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– 不锈钢（普通/可换柱芯） – 玻璃 – 聚合物（径向加压）、PEEK
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色谱柱的规格
内径
– 检测的灵敏度 – 样品的容量
长度
– 分离度，理论塔板数 – 速度 – 样品的容量 – 检测的灵敏度
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Waters色谱柱的内径
填料的热稳定性 –普通硅胶填料
柱温:≤60℃
–聚合物填料(高温GPC)
柱温:≤150℃
–杂化硅胶填料(XTerra)
柱温:≤90℃
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色谱填料的热稳定性
温度
pH
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填料基质物理性质的影响
填料基质的物理性质对色谱柱的影响
液相色谱填料的合成（2）
键合相(配体)： C18 端基封口基团
合成步骤：
1.合成硅胶基质 2.键合配体(键合相) 3.端基封口
残留硅羟基
硅胶基质
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不同硅胶的制作过程
硅酸钠沉淀： (无定形颗粒)
- µBondapak™ 硅酸钠聚合成硅酸 (硅胶)，之后研磨成小颗粒
对色谱柱填料的了解(七)
填料的pH稳定性
– 硅胶填料 pH：2-8 – 聚合物填料 pH：2-12 – 杂化硅胶填料 pH：2-12
硅胶的溶解曲线
pH值小于2时键合相水解 pH值大于8时硅胶溶解
1 2 3 4 5 6 7 8 9 pH
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对色谱柱填料的了解(八)
液相色谱柱
填 料
颗粒表面性质
化学性质∶ k，α
分辨率
柱 管
颗粒度
长 度
内 径
材 料
机械因素∶N
寿命，柱效，速度，溶剂消耗
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液相色谱柱基础 知识(2) 色谱柱使用与保养
色谱柱的连接
各种锥箍和管路接头长度示意图:
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色谱柱的连接
Stop_depth长度不合适造成柱前死体积
– 柱外扩散,造成色谱峰展宽
正常
死体积
峰扩散
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色谱柱的连接
锥箍锥度不合适造成渗漏
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Waters色谱柱的连接
Waters除Spherisorb以外的各种品牌的色谱柱用
传统硅胶颗粒基质 合成步骤：
– 1.合成硅胶基质 – 2.键合配体(键合相) – 3.端基封口
Polyethoxysilane (PEOS)
Tetraethoxysilane (TEOS)
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未键合的硅胶颗粒:孔表面
注意: 表面硅醇基 和微孔
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键合相色谱柱
以硅胶为基质，通过化学键合方式把碳十八、
碳八、胺基等基团联在基质上，作为固定相
优点∶
– 固定相稳定，不易流失 – 应用广泛，可使用多种溶剂 – 消除硅羟基的不良影响
缺点∶
– pH值不能小于2(键合相水解) – 同样填料，各种牌号色谱柱不尽相同
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– 硅胶基质 – 聚合物基质
色谱柱的性能主要取决于填料的性质和填充技术
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硅胶的结构
氢
硅
氧

无定形的多孔基质 － 硅原子与氧原子彼此结合 形成 “硅氧键” = (Si – O – Si)
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液相色谱填料的合成(1)
Waters 传统品牌的分析柱以3.9mm内径为主，比
一般分析柱(4.6mm)细，因此：
–相对灵敏度高 –省溶剂，可用相对较低的流速 –同样的流速下，柱压较高(高效柱尤为明显) 注意在用文献方法时转换流速,即:降低流速,以保持
线速度相同。
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色谱柱化学及外形与性能的关系
计算色谱柱的柱效 N
理论塔板数计算公式：
V1 N =σ W
W Wtan Wh W3σ W4σ W5σ
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2
σ 16 5.54 9 16 25
方法 切线法 半峰高 3σ 4σ 5σ
用“切线”法计算柱效
18.70 N = 16 4σ 0.80 2
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残基处理的效果
① 抗坏血酸 ② 烟酰胺 ③ 对氨基苯甲酸 ④ 哌咯西叮 ⑤ 核黄素 ⑥ 苯酚 ⑦ 盐酸硫胺
NovaPak C18
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ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ未封口 C18
对色谱柱填料的了解(四)
含碳量
–含碳量越高，k'值越大（固定相传质效应增加）
带有内嵌极性配体的色谱填料
Waters Symmetry Shield RP18…
O Si CH3 CH3
Polar Group
内嵌极性基团配体
(由一步合成过程而来)
O Si CH3 CH3
传统直链烷基配体
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对色谱柱填料的了解(三)
填料的端基封口 –封口残余硅羟基 –减少不可逆吸附或拖尾 –增加碳含量（0.1% - 1%）
高含碳量
–有利于不易保留的化合物的分离 –水解稳定性好，重现性好 –有利于极性化合物的拖尾改善
低含碳量
–有利于分析中性及碱性化合物 –降低溶剂损耗
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不同色谱柱的含碳量
色谱柱
Symmetry C18 Zorbax ODS LiChrosorb RP-18 Symmetry C8 Resolve C-18 Ultrasphere ODS Partisil ODS-3 µBondpak C-18 Nova-Pak C-18
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测柱效-良好的色谱实验习惯
拿到一根新色谱柱时，先测柱效 保留在新色谱柱上测得的色谱图，并记录色谱测
试条件
定期检测柱效 定期检测仪器的谱带展宽
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测柱效的方法
色谱柱种类繁多,性能各异,测定方法亦各不相同 Waters的色谱柱均附有Use and Care说明书,可
子量的分子
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硅胶的孔结构
孔占据大于99%的填料表面
被测物分 子量( MW) < 3,000 3,000 – 10,000 >10,000 非常大 推荐使用的 填料孔径 60 -130 Å (6 -13 nm) 125-200 Å (12.5-20 nm) 300 – 1,000 Å (30 -100 nm) 无孔填料
- Waters Xterra 3.5 µ,5 µ m
2004年 小颗粒(1.7 µ m)杂化填料
- Waters BEH （UPLC专用）
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对色谱柱填料的了解(一)
平均颗粒度，颗粒度分布
– 颗粒度 颗粒度越小：柱效越高(传质好，涡流扩散小)
“SolGel”1过程: (球形颗粒)
- Nova-Pak® 胶态硅球被熔融入色谱颗粒中
“SilGel”1过程: (球形颗粒)
- Symmetry® 纯硅烷聚合形成色谱颗粒
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硅胶颗粒技术的沿革
六十年代 七十年代 八十年代 1995年 2000年
薄膜无孔填料(表面积很低 <50 m2/g -- Corasil) 无定形多孔填料10 µm (Waters µBondapak™) 球形填料5 µm (Waters Spherisorb® 及 Waters Nova-Pak®) 高纯球形填料 3-5 µm (Waters Symmetry) 无机硅胶和有机硅胶杂化填料
– 平均孔径及其分布:影响被分析样品的分子量，大孔径
的可分析高分子量样品
– 平均孔体积及其分布:影响同孔径 – 含碳量:影响化合物的保留时间，高含碳量保留时间长 – 填料的端基封口:主要影响碱性化合物的峰形，未封口
会使碱性化合物拖尾
– 硅胶的活性:主要影响碱性化合物的保留行为：K’，高
活性的K’大
– 硅胶的杂质含量:更苛刻条件下的碱性化合物峰形
V = 16.63 R
= 8742 plates
V = 18.70 R
16.63 N 4σ = 16 0.68 = 9569 plates
2
不好的色 谱柱的柱效反 而比好色谱柱 的要高，因为 其拖尾部分测 不出来
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液相色谱柱的分类
从柱子类型上分：
– 分配/吸附，离子交换，凝胶，亲合
从柱体积及柱结构上分：
– 内径：2.1mm以下(微径柱)、 3.9mm ~ 7.8mm(分析柱)、
7.9mm ~ 50mm（制备柱）
– 长度：5cm ~ 60cm
从柱体材料上分∶
按说明书所述方法测定
以下是Waters反相C18柱的测定方法:
– 流动相:乙腈/水=60:40;流速:1ml/min – 样品:50mg Acenaphthene(二氢苊)溶于100ml乙腈,加
入600μl丙酮
– 进样量1–3μl – 检测波长:254nm
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柱压越高(渗透性差)
– 颗粒分布 颗粒分布越宽:柱效低(渗透性差) – 颗粒形状 球型:柱效高、重现性好、柱床结构均匀 无定型：柱床结构不均匀,流动相线性速度不均匀
谱带扩展
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硅胶颗粒的形状
不规则形状 (Irregular)
– 大硅胶颗粒研磨，筛分 – 颗粒尺寸和表面积限制
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液相色谱教程 (四)
液相色谱柱基础知识
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液相色谱柱基础 知识(1) 色谱柱及其填料
高效液相色谱柱简介
色谱柱是一根填满填料的管子 柱管的材料(塑料,玻璃,不锈钢…)和尺寸(内径,长
短)不尽相同
管内的填料更是种类繁多,主要分为两大类
C%
19 17 15 12 12 11 11 10 7
k'苊 (50/50的乙腈/水)
17 15.7 10.3 12.5 12.4 11.3 12.0 7.9 5.5
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对色谱柱填料的了解(五)
平均孔径/孔体积 孔径/孔体积分布 –大的孔径可分析高分
注意：孔径是分布值
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Si-OH = 硅羟基（Silanol）
硅胶的孔结构
C18
H3 C O CH 3 Si
键合并端基封口后
CCCCCCCCCCCCCCCCCC
25 Å “立体位阻”
H3 C O CH 3 Si CH 3
封口基团
还能看见什么？硅羟基! — 即使进行高密度键合， 硅胶表面仍将残留约50%硅羟基(SiOH)!
的是“Waters”标准，其stop-depth的长度为 0.130英吋
Spherisorb品牌的色谱柱及Phase Separations
公司的其它品牌色谱柱用的是“Parker-style”标 ，其stop-depth为0.090英吋
连接Waters 色谱柱最好使用整体式PEEK工程塑
料接头,(P/N PSL613315 ),耐压 5000Psi;亦可适 用于不同厂家的色谱柱与Waters仪器的连接