【CN109988846A】一种适于红螯螯虾性腺组织mRNA石蜡切片原位杂交的方法【专利】
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(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910178865.X
(22)申请日 2019.03.11
(71)申请人 浙江省淡水水产研究所
地址 313001 浙江省湖州市杭长桥南路999
号
(72)发明人 郑建波 贾永义 顾志敏 程顺
李飞 迟美丽 刘士力 蒋文枰
(74)专利代理机构 北京国翰知识产权代理事务
所(普通合伙) 11696
代理人 卫翠婷
(51)Int.Cl.
C12Q 1/6888(2018.01)
C12Q 1/6811(2018.01)
C12Q 1/6841(2018.01)
C12N 15/11(2006.01)
C12N 15/10(2006.01) (54)发明名称
一种适于红螯螯虾性腺组织mRNA石蜡切片
原位杂交的方法
(57)摘要
本发明提供一种适于红螯螯虾性腺组织
mRNA石蜡切片原位杂交的方法，属于原位杂交技
术领域，包括性腺组织包埋、
石蜡切片、原位杂交和拍照记录，其中原位杂交采用探针序列为如
SEQ ID NO.3所示。
本发明探针对dsx基因的的组
织定位有明确的特异性，实现了对dsx基因mRNA
水平的显示作用；本发明在红螯螯虾中建立了石
蜡切片mRNA原位杂交的方法来研究相关基因在
性腺中的表达模式，能够清晰地描述红螯螯虾性
别相关基因在性腺中的表达定位；本发明方法在
石蜡切片脱蜡效果佳的同时避免组织收缩和细
胞变形，使得组织仍保持在原位，组织形态保持
完整，还能提高酶解效果，使得细胞着色好，核质
分明，
最终提高原位杂交的准确性。
权利要求书2页 说明书5页序列表1页 附图1页CN 109988846 A 2019.07.09
C N 109988846
A
权 利 要 求 书1/2页CN 109988846 A
1.一种适于红螯螯虾性腺组织mRNA石蜡切片原位杂交用探针的方法，其特征在于，按照如下步骤：
S1步骤：以逆转录得到的红螯螯虾性腺组织cDNA为模板，利用引物通过PCR反应扩增得到dsx基因的部分ORF序列，该序列作为dsx基因mRNA特异的探针序列；
S2步骤：构建dsx基因mRNA原位杂交的探针质粒，将探针质粒转化细菌后，细菌培养后进行测序；
S3步骤：制备dsx基因mRNA原位杂交探针。
2.根据权利要求1所述的一种适于红螯螯虾性腺组织mRNA石蜡切片原位杂交用探针的方法，其特征在于：所述dsx基因在精巢中表达，而在卵巢中不表达。
3.根据权利要求1所述的一种适于红螯螯虾性腺组织mRNA石蜡切片原位杂交用探针的方法，其特征在于：所述引物的
正向引物为：5’-GAATTCTAATACGACTCACTATAGGGA-3’；
反向引物为：5’-CCTATAGTGAGTCGTATTAAAGCTT-3’。
4.一种适于红螯螯虾性腺组织mRNA石蜡切片原位杂交用探针，其特征在于：采用权利要求1或2或3所述的方法制得。
5.根据权利要求4所述的一种适于红螯螯虾性腺组织mRNA石蜡切片原位杂交用探针，其特征在于：所述探针序列为如SEQ ID NO.3所示。
6.一种适于红螯螯虾性腺组织mRNA石蜡切片原位杂交的方法，包括性腺组织包埋、石蜡切片、原位杂交和拍照记录，其特征在于：所述原位杂交采用权利要求4所述的探针。
7.根据权利要求6所述的一种适于红螯螯虾性腺组织mRNA石蜡切片原位杂交的方法，其特征在于：所述的原位杂交包括如下步骤：
1)石蜡切片脱蜡：将切片依次用二甲苯、无水乙醇、85％酒精、75％酒精、DEPC水洗进行脱蜡；
2)消化：将水洗后切片于修复液中煮沸，自然冷却后基因笔画圈，根据不同组织不同指标特性，滴加蛋白酶K消化，冲洗；
3)预杂交：将消化后切片上滴加预杂交液，孵育；
4)杂交：倾去预杂交液，滴加含探针杂交液，杂交过夜后洗涤；
3)封闭：滴加封闭血清BSA，倾去封闭液，然后滴加anti-DIG-HRP，孵育；
4)DAB显色：切片稍甩干后，在圈内滴加新鲜配制的DAB显色液，显微镜下控制显色时间，阳性为棕黄色，纯水冲洗切片终止显色；
5)复染细胞核：用苏木素染液复染，水洗后经1％盐酸酒精分化，水洗，氨水返蓝，冲洗；
6)封片：中性树胶封片。
8.根据权利要求7所述的一种适于红螯螯虾性腺组织mRNA石蜡切片原位杂交的方法，其特征在于：所述二甲苯中含有0.03-0.06％三氯乙醛和2.8-3.0％苯芴醇。
9.根据权利要求7所述的一种适于红螯螯虾性腺组织mRNA石蜡切片原位杂交的方法，其特征在于：所述探针杂交液的浓度为50ng/ul。
10.根据权利要求6所述的一种适于红螯螯虾性腺组织mRNA石蜡切片原位杂交的方法，其特征在于：所述性腺组织包埋包括如下步骤：
将组织取出洗净后立即放入固定液中固定2-12h，固定完成后经梯度酒精脱水后浸蜡，
2。