第七章 植物原生质体培养及细胞融合2014

三、培养条件
新分离出来的原生质体
应在散射光或黑暗中培养。
培养温度一般在25-30℃下。
四、培养方法
1. 液体浅层培养
原生质体悬浮在液体培养基（约2×105/ml密度） —将原生质体悬浮液移到直径为6cm的培养皿中（2-3mm为宜） —5-10天后开始原生质体分裂
优点
▲通气好； ▲原生质体代谢物易扩散，防止有害物质积累过多造成毒害；
2.培养方法 1）饲养细胞层法
用X射线或紫外线照射细胞（106），抑制细胞分裂，但不破坏细胞代谢， 将其清洗， 植板在软琼脂培养基上，此平板称饲喂层， 然后将未照射处理的原生质体铺在饲喂层上。
特点
以一种植物细胞制成的平板， 支持另一种植物原生质体的生长。 饲喂层没有种的特异性。 烟草原生质体植板密度低于104时，一般不能分裂， 用此方法，植板密度可低至10-100。
原始pH值提高到7.0时， 生活的原生质体数量进一步增加， 损伤的原生质体也少得多。
分离叶肉原生质体的完整流程
表面灭菌的叶片 ①撕去下表皮 酶溶液及渗压稳定剂 ②抽真空、振荡 原生质体沉于培养皿底 （叶段漂浮其上） 保温8hr
③
⑤离心2次， 原 生 质 体 （ 上 层 ） 第2次离心前重新悬浮于高蔗糖清洗液中
缺点
◆原生质体的产量低； ◆方法繁琐费力；
◆对分生细胞和其它液泡化程度不高的细胞不适用。
未得到广泛应用。 优点
能够排除外加酶对离体原生质体的结构和代谢活性的有害影响。
2. 酶分离法
1960年， Cocking首先利用纤维素酶处理番茄根尖， 分离得到收率高、活力强、完整性好的原生质体。 1968年， 纤维素酶和离析酶商品化生产后， 大量进行植物原生质体的研究。
现在用不同连续梯度Ficoll（聚蔗糖）溶液， 上面为酶-原生质体混合液， 经离心（150g，5min）, 不同比重的原生质体漂浮在不同浓度梯度的界面上。 优点：收获的原生质体大小均匀一致。 缺点：收率低。
纯化后的叶肉原生质体
（二）原生质体活力的测定
1.以胞质环流作为进行活跃代谢的指标，
但对在细胞周围携有大量叶绿体的叶肉细胞原生质体来说， 这种方法的作用不大；
3. 界面法
采用2种或2种以上密度不同的溶液， 离心后使完整的原生质体处在两液相的界面。
最早Hughes(1978) 两液相 下层：450mM/L蔗糖 上层：450mM/L甘露醇
Piwowarczyk（1978）改进了上述方法 两液相 下层：培养基，含500mM/L蔗糖 中层：培养基，含140mM/L蔗糖，360mM/L山梨醇 上层：含原生质体酶液，含300mM/L山梨醇和100mM/LCaCl2
原生质体包括
▲ 细胞质膜
▲ 膜内细胞质 ▲ 其他具有生命活性的细胞器，
如细胞核、线粒体和高尔基体等。
原生质体培养意义
是植物细胞工程的核心技术。 1. 除去了细胞壁， 为植物细胞之间的融合扫平了障碍， 实现体细胞杂交，为制造新杂种开辟了道路。 (克服远缘杂交不亲和性)
2. 原生质体是各种遗传操作的理想受体， 从而可以进行品种的遗传改良。 可摄入外源DNA，细胞器、细菌或病毒颗粒， 为高等植物的遗传饰变打下基础。
能除去抑制分裂的有害物质，细胞植板率高。
缺点
原生质体易受热伤害，易破碎。
五、低密度培养
与细胞培养相似， 原生质体初始植板密度对植板效率有显著的影响。 原生质体培养的一般密度为104-105。 高密度下， 个别原生质体形成的细胞团在相当早时就交织在一起， 如果原生质体群体在遗传上是异质的，就会形成嵌合体组织。
▲转移添加新鲜培养基方便，便于观察和照相； ▲操作简单； ▲可微量培养，细胞植板率高。
缺点：原生质体沉淀，分布不均；
细胞团聚集多，难成单细胞株系。
2. 固体/平板培养
原生质体（密度为4×105/ml）与等量体积琼脂糖培养基均匀混合 —置于6cm培养皿（2-3mm）, —暗培养 —5-7天原生质体开始分裂。
◆ 半纤维素酶 降解半纤维素为单糖或单糖衍生物。
◆ 果胶酶
使细胞间的果胶质降解，把细胞从组织内分离出来。
此外，还有蜗牛酶（主要用于花粉母细胞和四分体细胞）等。
原生质体酶分离法
◆两步分离法
用果胶酶离析植物组织，收集细胞； 经洗涤后用纤维素酶解离细胞壁，然后获得原生质体。 日本产的Onozuka纤维素酶常和果胶酶结合使用。
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2.以氧的摄入量作指标，
摄入量可通过一个能指示呼吸代谢强度的氧电极进行测定。
3.以光合活性作指标。
4.以完整的质膜排斥伊凡蓝的能力作指标。
5.以荧光素双醋酸酯（FDA）的染色能力为指标。
第二节
一、供体植物的选择
原生质体培养
供体组织的生理状态很重要。
一般情况下， 在可控光、温、湿的环境条件下能得到重复的结果，
在人工控制下互相融合成一体。
自然条件下，原生质体自然融合频率极低，
必须加以一定的方法诱导，才能促进原生质体的融合。
壁的形成与细胞分裂有直接关系， 凡是不能再生壁的原生质体就不能进行正常的有丝分裂。
愈伤组织形成后，转入不含渗透压调节剂的培养剂中， 其培养及植株再生与一般组织培养方法相同。
原 生 质 体 培 养 的 程 序
第三节 原生质体融合
一、原生质体融合意义
原生质体融合也称体细胞杂交， 即，分离下来的不同亲本杂交的原生质体，
3. 获得细胞无性系和选育突变体的优良起始材料。
第一节
原生质体的分离与纯化
一、原生质体的分离
（一）材料来源
植物的茎、叶、胚、子叶、下胚轴等器官组织 以及愈伤组织和悬浮培养细胞均可作为原生质体分离的材料。
目前较多采用叶片分离原生质体， 但分裂旺盛的、再分化能力强的愈伤组织或悬浮细胞系， 尤其是胚性愈伤组织或胚性悬浮细胞系 是最理想的原生质体分离材料。
如果溶液中的渗透压和细胞内的渗透压不同，原生质体有可能涨破或收缩， 因此在酶液、洗液和培养液中渗透压 应大致和原生质体内的相同，或者比细胞内渗透压略大些。 较高水平的渗透剂可以阻止原生质体的破裂和出芽， 但同时也可能抑制原生质体的分裂。
①糖溶液系统
包括甘露醇、山梨醇、蔗糖和葡萄糖等，浓度约在0.40-0.80mol／L。 可促进分离的原生质体再生细胞壁并继续分裂；
优点
原生质体分布均匀，利于分裂，容易获得单胞株系； 可定位观察。
缺点
原生质体易受热伤害，易破碎； 原生质体始终处于高渗透压胁迫下生长发育缓慢，植板率低。
3. （固、液）双层培养 原生质体采用平板培养方法包埋在培养皿底层；
上面再加入相同成分的液体培养基，
暗培养。 需更换新鲜液体培养基。 优点
原生质体分布均匀，有利于分裂，易获单细胞株系；
在体细胞杂交和诱发突变的研究中， 最好能获得个别细胞的无性系。 需要低密度（100-500）原生质体培养。
1. 培养基 KM8p Kao&Michayluk（1975） Vicia hajastana（一种蚕豆）单细胞再生出壁，并分裂形成愈伤； 在苜蓿、豌豆和Vicia中培养中， 低密度下（小于100）分裂的更快； 培养马铃薯原生质体及 马铃薯/番茄原生质体融合产物 获得成功。 黑暗或近于黑暗（50lx）培养。
两室
大的内室：很多小穴，加入原生质体悬浮液（0.25-0.5µ l）； 小的外室：注入无菌水，保持培养皿内湿度。
可进行单个原生质体培养。
六、细胞壁的形成
培养2-4天，原生质体失去其特有的球型外观，这是再生新壁的象征。
研究认为，
旋花科植物原生质体只有在外源供应一种易于代谢的碳源（蔗糖）时， 细胞壁才能再生。 培养基中若存在电解质渗透压调节剂时会抑制壁的再生。
②盐溶液系统
包括 KCl、MgSO4和 KH2PO4等。 此外，酶溶液里还可加入适量的葡聚糖硫酸钾， 提高原生质体的稳定性；使RNA酶不活化；并使离子稳定。
◆pH
酶溶液的pH值 对原生质体的产量和生活力影响很大。
用菜豆叶片作培养材料时发现 原始pH值为5.0时，原生质体产生得很快， 但损坏较严重，并且培养后大量破裂。 当pH值提高到6.0时，最初原生质体却产生少， 但与pH值为5.0时处理同样时间后相比，原生质体数量显著增加。
2）共培养法 2种类型的活跃代谢和正在分裂的原生质体 混合在液体培养基中一起培养。 用于某些物种原生质体或杂种细胞的培养。
条件 2个物种原生质体间能发生有效的互馈； 其产生的愈伤组织形态上能彼此区分。
3）Cuprak微滴法 高国楠（1977）及Gleba（1978） 设计特别培养皿培养单个原生质体及其再生的细胞。
优点：操作方便；损失少。
缺点：纯度不高
2. 漂浮法
利用比重大于原生质体的高渗蔗糖溶液，离心后 原生质体位于蔗糖溶液和原生质体悬浮培养基的界面上， 残渣碎屑沉到管底。
先加蔗糖溶液（20%左右）， 酶处理混合液置于其上， 离心，150g，5min 用液体培养基或甘露醇溶液悬浮洗涤2-3次, 1-2ml液体培养基悬浮原生质体，备用。 优点：纯度高 缺点：收率低。
◆一步分离法
一定量的纤维素酶和果胶酶组成混合酶液，对材料进行一次性处理。 上海植物生理研究所生产的ZA3-867纤维酶是多种酶的复合物，
含有纤维素酶，果胶酶，半纤维素酶等，分离细胞壁的效果较好。
酶液的配制
◆酶的配比和浓度
果胶酶/纤维素酶 纯度高， 但浓度不宜太高； 木本植物加入半纤维素酶。
◆渗透稳定剂
第七章 原生质体培养
内容
植物原生质体分离， 植物原生质体培养， 植物细胞融合。
要求
了解原生质分离、纯化、活力测定及其影响因素， 掌握植原生质体培养的方法、步骤和影响因素； 理解植物细胞融合的原理及方法。
原生质体（protoplast）
植物细胞中除去细胞壁的裸露的有生活力的部分。
除了没有细胞壁外，具有细胞的一切特征。
◆低温处理
龙胆试管苗的叶片只有用4℃低温处理后，分离得到的原生质体才能分裂。
（在很多情况下材料不必经过专门的预处理）
（二）原生质体分离方法
1. 机械法
Klercker于1892年最早进行分离高等植物原生质体的研究。 其方法是把细胞置于一种高渗的糖溶液中，使细胞发生质壁分离， 原生质体收缩成球形，然后用利刃切割， 发生质壁分离的细胞壁被切去后释放出原生质体。
培养基中生长素和细胞分裂素的水平要做适当调整。
3. 渗压剂
在没有再生出一个坚韧的细胞壁之前，原生质必须有培养基渗透压的保护。 高渗溶液，培养时一般逐步过渡。 通常的渗透剂是甘露醇和山梨醇。 MS＋NAA 2.0ppm＋BA 0.5ppm＋3％蔗糖＋9％甘露醇
4. pH：5.6-6.0
培养基 用醋酸纤维微孔滤膜过滤灭菌。
即在无菌条件下生长的幼苗制备原生质体较好。
二、原生质体培养基
1. 基本培养基 MS和B5，或其衍生的培养基。
CaCl2促进细胞分裂。 钙可增强原生质体稳定性，提高分裂频率， 明显改变细胞质内外的离子交换。 NH4NO3降低细胞分裂频率。
2. 生长调节物质
生长素/细胞分裂素类。 针对不同的研究对象，
原生质体 悬浮于清洗液中
④
吸掉酶液
⑥重新悬浮于培养基中 取少量样品用血球板计数
以适当的植板密度 重新悬浮于培养基中
二、原生质体的纯化与活力测定
（一）原生质体的纯化 1. 沉降法（过滤离心法）-应用最广
利用比重原理，低速离心使原生质体沉于底部。
过滤酶处理混合液，30-40µ m微孔滤膜， 低速离心，150g以下，3-5min，弃上清， 用液体培养基或甘露醇溶液悬浮洗涤， 重复2-3次， 1-2ml液体培养基悬浮原生质体，备用。
材料预处理
意义
▲提高原生质体的分裂频率； ▲逐步提高植物材料的渗透压，以适应培养基中的高渗环境。
方法 ◆暗处理
豌豆枝条取下后，分离原生质体前，先在黑暗中（一定湿度）放1-2d， 提高原生质体存活率高，并能继续分裂；
◆预培养
羽衣甘蓝先去叶下表皮，再在诱导愈伤组织的培养基中预培养7d，再去壁， 原生质体高度液泡化，叶绿体也解体；
现在
果胶酶处理 → 单细胞－－纤维素酶处理 → 原生质体
分离原生质体最有效方法。
细胞壁的组成
纤维素 25-50％ 纤维素酶 半纤维素 53％ 半纤维素酶 果胶质 5％ 果胶酶 少量蛋白质
酶的种类及特点
◆ 纤维素酶
主要含有 纤维素酶C，作用于天然的和结晶的纤维素，具有分解天然纤维素的作用， 还含纤维素酶CX，作用于定形的纤维素，可分解短链纤维素， 另含有纤维素二糖酶、木聚糖酶、萄聚糖酶、果胶酶、脂肪酶、磷脂酶、 核酸酶、溶菌酶等， 总体作用是降解纤维素，得到裸露的原生质体。