狂犬病实验室检测技术

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• （2） 以下步骤可在普通实验室进行
-70℃取出，室温融化→加 200μ l 氯仿， 快速颠倒 Epp 管数次（30 秒），使其呈淡粉红色 ↓ 室温放置 3min ↓ 4℃离心，12000rpm，15min （其间标记新的离心管，每管中加 600μ l 异丙醇） ↓ 取离心后水相 600μ l，加入新的离心管中，轻柔混匀 ↓ 室温放置 10 min （－20℃放置 30 分钟效果更佳） ↓ 4℃离心，12000rpm，10min ↓
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• • • •
注意事项： 1. 操作时一定戴口罩手套，保证离心管枪头无 RNA 酶 2. 一次提取核酸，样本数不要太多（10 个左右） 3. 加入氯仿后到加入异丙醇之前的操作应尽量快速且作用时间准确， 否则容易降低提取效率 • 4. 异丙醇和乙醇作用时间略长不影响结果 • 5. 加入异丙醇后所有的混均操作要轻柔，加液体时贴壁缓流，以免破 坏到所提核酸 • 6. 尽量缩短 RNA 在空气及室温的暴露时间，水溶的 RNA 一定要低温 保存
• 通常第一次采用能扩增较大片段的引物，经过循环扩增后，将第一次 扩增的产物作为模板进行第二次扩增。 • 优点： • 特异性、灵敏度均比常规 PCR好。 • 缺点： • 比常规 PCR易污染。
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巢 式 PCR 方法的操作：
1、RNA 提取：Trizol 法
• （1）以下步骤在 P2 生物安全柜中进行 取不同位置的少量脑组织（50-100mg）＋ 1000μ l Trizol 先加 200μ l（研磨均匀）然后加满至 1000μ l [液体（唾液、尿液等）取 250μ l ＋ 750μ l Trizol LS] ↓ -70℃过夜或颠倒 Epp 管 30～40 次以便充分混匀内容物， 室温放置 5 分钟 （此步完可-70℃保存 1 个月）
↓
骤
固定(弃掉培养液，PBS 洗一次，丙酮固定)
↓
荧光抗体检测(干燥后，加荧光素标记的抗狂犬病毒抗体，37℃ 30 分钟)
↓
观察结果( PBS 洗3 次，荧光显微镜观察结果)
↓
计算中和抗体滴度(实验组中能使荧光灶抑制≥50％的血清最高稀释倍数，即为被检血清的中和抗体滴度)
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3、病毒分离
A. 细胞培养法——分离病毒 • 研磨标本 → 制成悬液（用PBS 或MEM ，30％ ）→ 离心（ 4℃ 2000r/min 离心20 m） → 取上清接种细胞（鼠神经瘤细胞、Vero 细胞 或BHK21 细胞） → 吸附（ 2 h） → 加维持液 → 孵育(37℃ 、5％ C02 、4～5 天) → 鉴定 B. 乳小白鼠接种法——分离病毒 • 研磨标本 → 制成悬液 → 离心 → 取上清接种乳鼠脑内（ 1～2 日龄） → 饲养 → 观察发病情况(未发病的鼠保留至21 天后作DFA检测)
→故机体无免疫应答反应（针对狂犬病毒）。 晚期，狂犬病→破坏血脑屏障→ 大量病毒抗原→进入血流→ 刺激机体→产生大量特异性抗体。 因此，通常在发病早期血清中查不到抗体或抗体滴度很低，只在
临床疾病的晚期出现。
在感染后，狂犬病毒或其抗原→不能与机体免疫系统广泛接触
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A. 快速荧光灶抑制试验（RFFIT）—— 测定中和抗体
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• 4、个人防护 实验前要穿戴好防护服、眼镜、手套， 作好技术上的准备。 • 5、防止气溶胶扩散 由于空气传播狂犬病毒已经得到证实，因此高速混悬或离心操作 应在密闭状态下进行。 • 6、实验后消毒处理 实验后要作好善后消毒处理, 狂犬病毒对脂溶剂（肥皂水、醚、氯 仿、丙酮），45～70%乙醇，碘制剂和四铵化合物敏感，操作完毕对 操作台、实验材料等要用相应的消毒剂或高压蒸汽进行消毒处理。
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（三）实验前准备 • 1、实验室及仪器的准备（略） • 2、各种试剂及材料的准备（略）
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实验室检测方法
• • • • • （一）DFA 法 （二）巢式 PCR 法 （三）其它检测方法 （四）狂犬病诊断标准（WS281-2008）中的检测方法 （五）美国 CDC 狂犬病实验室操作手册中的检测方法
狂犬病实验室检测技术
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• 一、实验室操作前的要求及准备 • 二、实验室检测方法
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实验室操作前的要求及准备
• （一）实验室条件及生物安全操作要求 • （二）检测标本的要求 • （三）实验前准备
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（一）实验室条件及生物安全操作要求
• 1、暴露前免疫 工作人员需要暴露前免疫 意外暴露于狂犬病毒时,必需立即报告部门负责人。 • 2、P2实验室 操作所有潜在狂犬病感染的材料均应在P2 或P3实验室内进行 (实验室固定毒在P2，病人或动物分离的街毒在P3）。 • 3、P3实验室 对动物标本进行狂犬病毒分离时，必须在P3 以上条件的专业实验 室中进行。 • 没有P3 实验室，严禁从事狂犬病毒分离工作。
4℃过夜；
• 封闭：用含0.3％牛血清白蛋白和5% 蔗糖的pH9.6 碳酸盐缓冲液封闭30分钟； • 加待检标本：将采集到的标本研磨，用pH 7.4 PBS制成30％的悬液，离心取上清加 • • 加酶标抗体：后加入纯化的酶标记抗狂犬病毒抗体200μl/孔，37℃ l 小时； • 洗板：同上； • 加底物：加入酶反应底物，室温作用30 分钟；
搅拌器及染色缸 • vi. 封片镜检： 用 90％甘油（ PBS）封片，加盖玻片，荧光显微镜观察。
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结果判断：
仔细观察每个视野的荧光强度，并结合不同视野
的荧光分布，作出荧光强度的等级判断：阴性、可疑、 ＋~ ＋＋＋＋ • －：无荧光； • ＋/－：极弱的可疑荧光；
无荧光“－”
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• ＋：荧光较弱，但清晰可见；
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（一）DFA 法（直接荧光抗体法）
——检测狂犬病毒抗原 免疫荧 光技术
Ab
Ag(尤其是不产生 细 胞病变的病毒
优点
安全
快速
简便
敏感性和特 异性较高
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荧光抗体的染色方法可分为两类： • 直接法 — 荧光抗体直接与标本内的抗原反应,
优点简便、快捷、有效减少非特异性染色, 只适用于检测细胞内的抗原； 间接法 — 荧光抗体作为第二抗体，与直接结合胞内抗原的第一抗体反应, 既可检测胞内抗原，也可以检测体液中的特异抗体 相对直接法操作步骤增多
伸扩增；
• 检测过程：通过电泳等方法对PCR产物进行检测。
Sample
Extract RNA or DNA
PCR
Electrophoresis
photograph
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巢式 PCR（nested－PCR）： • 巢式 PCR的原理： 是设计两对引物，其中一对引物在另一对引物扩增产物的片段上， 通过二次 PCR 反应对某个基因进行检测。
制备细胞悬液( 1×10
↓
cells/ml 的 BSR 细胞悬液)
快速荧光灶抑制试验（RFFIT）： 为WHO 推荐的检测方法
稀释血清和病毒(待测血清、对照血清、标准血清、病毒固定毒CVS 株）
↓
中和血清和病毒( 0.1ml血清 和标准病毒稀释液0.1 m1 ，37℃中和1.5 小时)
步
↓
检测剩余病毒(每孔加入 50 µl 制备好的细胞悬液，37℃、5% C02 过夜培养)
2、ELISA——检测狂犬病毒抗原
•
意义： 检测到狂犬病毒抗原阳性有诊断意义。
3、细胞培养方法——分离狂犬病毒 • 意义：
阳性结果表明有狂犬病毒感染，有确诊意义。
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4、RT-PCR——检测狂犬病毒核酸
• 原理： 狂犬病毒为负链RNA病毒，PCR前需要经过逆转录酶作用，合成 一条cDNA链（RT）,再进行PCR。
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3、巢 式 PCR：
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琼脂糖凝胶电泳
• • • • • 1．电泳槽中注入缓冲液 TAE 2．将做好的琼脂胶放入电泳槽（加样孔在负极方向） 3．Marker 加 5 ul，样品加 10ul 5．电压：100V 6．时间：30min
照相：凝胶成像仪/紫外透射仪
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（三） 其它检测方法
1、ELISA——检测抗原： • 包被抗体：用pH 9.6 的碳酸盐缓冲液稀释的抗狂犬病毒核衣壳IgG 包被96 孔酶标板，
• 意义： • 中和抗体水平等于或高于0.5IU/ml 血清，表示能得到有效的保护
B. ELISA—— 检测狂犬病毒抗体
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（二）检测标本的要求
• 1、采集时间 （1）应尽量采集较新鲜的标本。 （2）采集时无菌操作，避免标本污染 • 2、标本保存 （1）尽量低温保存 （2）存放于无菌离心管中并进行编号。 • 3、标本类型 （1）唾液、脑脊液、眼角膜、咬伤处皮肤组织、脑组织、血清等。 （2）唾液、脑脊液、眼角膜、咬伤处皮肤组织、脑组织等均可用于 病原学检测，其中以脑组织中的阳性率最高； 血清和脑脊液可用于抗体的检测。
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缓缓倒掉上清，用枪头轻轻吸去残存液体，可见少量沉淀 ↓ 加 1ml 75％乙醇（DEPC H2O 新鲜配制）洗涤沉淀 ↓ 4℃离心 12000rpm，10min ↓ 缓缓倒掉上清，用枪头轻轻吸去残存液体，室温干燥数分钟 （加入 75％乙醇至－70℃可长期贮存 1～2 年） ↓ 脑组织的沉淀溶于 70ul DEPC H2O 中(2 个 EPP 管分装) [液体（唾液、尿液等）的沉淀 溶于 35ul DEPC H2O 中] ↓ 直接进行逆转录或－70℃贮存
• • 终止反应：加2M H2SO4 终止反应； 观察结果：肉眼观察或酶标仪测定结果。
入酶标板孔内，同时设阴性、阳性对照，200 μ l/孔，37℃孵育1 小时； 洗板：洗板四次；
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2、荧光灶抑制试验——检测中和抗体 中和抗体： • 为疫苗免疫力程度的评判指标
•
•
中和抗体水平等于或高于0.5IU/ml 血清，表示能得到有效的保护
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• ＋＋：荧光明亮，且多个视野均有分布；
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•
＋＋＋～＋＋＋＋：荧光闪亮，可见尼基氏小体清晰， 且范围广泛；
荧光强度“＋＋＋”
荧光强度“＋＋＋＋”
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（二）巢式 PCR 方法——检测狂犬病毒核酸 传统的 PCR 检测模式一般需要三个步骤： • 制备模板：对待测标本进行核酸（DNA或 RNA）提取 • 扩增过程：采用 PCR 或 RT-PCR 技术对核酸进行变性、退火、延
•
• DFA原理： 抗体蛋白分子 + 荧光素
+ 抗原→形成抗原抗体复合物→通过荧光显微镜→检测抗原
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操 作：
1、材料和仪器 2、操作步骤 • i. 印片： 用酒精浸泡载玻片 30 分钟后取出、吹干， 分别取不同部位的脑组织剖面, 均匀的涂印在载玻片上； • ii. 固定： 吹干后，取冷丙酮（4℃）室温固定 7～10 分钟； 取出吹干，进行步骤3，或置于－ 70℃冰箱保存；
• 检测步骤：
1）病毒RNA的提取 2）逆转录合成cDNA 3）PCR扩增 4）电泳
• 意义：
阳性结果表明有狂犬病毒感染，有确诊意义。
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5、狂犬病特异性抗体检测 • 狂犬病特异性抗体：
入机体伤口→在入侵部位基本上不增殖（一般也不侵入血流） →故 不能形成病毒血症。
在自然感染情况下，狂犬病毒→通过带有病毒的动物唾液→进
• iii. 加荧光抗体： 将稀释好的荧光抗体滴加在固定好的抗原片上
（如果从 冰箱中取出，则待雾气散掉后再进行此步骤。）；
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• iv. 孵育： 将抗原片放在湿盒中， 37℃温育30 分钟； • v. 洗片： 取出后，用缓流冲洗抗原片 3～5 秒， 再用 PBS 振洗 2 遍， 蒸馏水振洗 1遍，每次 2 分钟，吹干；
• 7. 标本及时放回-20℃或-70℃
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2、逆转录合成cDNA
1）pd(N)6 稀释至 0.2ug/ul
2）水浴预热至 65℃（其间标记反应管） 3）33ulRNA 液 65℃水浴 10min（其间准备冰盒或碎冰）
4）冰浴 2min，瞬时离心。
5）将液体转移至试剂盒反应管中 32ul，先不要混匀。 6）再向反应管中加入 1ul pd(N)6 0.2ug/ul 或特异引物各 0.5ul，使总体 积达到 33ul，室温 1min，混匀，瞬时离心。 7）37℃水浴，60min 8） -20℃或-70℃保存 cDNA
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4、ELISA——检测狂犬病毒抗体
• ELISA方法测定的是总抗体， • 不代表具有保护性的中和抗体水平 • 其结果仅供参考。
5、染色镜检——检测内基氏小体
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（四）狂犬病诊断标准（WS281-2008）中的检测方法 1、DFA法——检测狂犬病毒抗原
•
意义： 阳性结果，表明有狂犬病毒感染，有确诊意义。