小鼠肝细胞的分离培养

第26卷第4期1998年12月

衡阳医学院学报

Jou rnal of H engyang M edical Co llege

V o l.26N o.4

1998小鼠肝细胞的分离培养①

陈敏时　陈　新　刘传爱②

(衡阳医学院流行病学教研室,衡阳市,421001)

摘　要　采用0.1%的胰蛋白酶消化乳小鼠肝组织块,用DM E M培养基进行肝细胞的培养,1周后可见细胞生长,30d左右细胞铺满培养瓶,培养的肝细胞能分泌白蛋白,培养第20天白蛋白分泌量达高峰。

关键词　胰蛋白酶;　肝细胞;　分离培养

哺乳动物肝细胞不易在体外生长,80年代以来国外采用两步胶原酶灌注法分离肝细胞[1],并以双层鼠尾胶原凝胶培养[2]或肝细胞-非实质细胞混合培养[3],成功地进行了肝细胞的原代培养。但这些方法操作复杂,价格昂贵。我们采用胰酶消化、组织块培养的方法进行肝细胞原代培养成功,现将结果报告如下。

1　材料与方法

1.1　试剂

1.1.1　0.1%的胰酶　胰蛋白酶1g,加D2

H ank s液100m l溶解,4℃过夜,滤纸过滤除菌,调pH值至7.2冷冻保存,临用前用D2

H ank s液稀释。

1.1.2　基础培养液　DM E M培养基(低糖) 10g,N a2CO33.7g,三蒸水1000m l溶解,调pH值至7.2～7.4,玻沙滤器过滤除菌,临用前100m l加入小牛血清10m l,青霉素1万单位,链霉素10m g,氢化可的松、灭菌1M H EPES

0.4%牛胰岛素各0.25m l。

1.2　动物

3～6日龄昆明小鼠,由本校实验动物部提供。

1.3　肝细胞的分离和培养

处死小鼠,无菌分离肝脏,置D2H ank s液中,冲洗肝脏至灰白色,将肝脏剪成1mm×1mm×1mm的组织块,用D2H ank s液洗3次,去掉血细胞,37℃下用0.1%的胰蛋白酶消化10m in,倒掉消化液后用D2H ank s液洗2次,培养液洗2次,将肝组织块贴壁于组织培养瓶中,每个培养瓶放组织块30～35块,加少许培养液,将培养瓶倒转置于培养箱中,在37℃、5%CO2条件下培养,3h后补充4m l培养液,并翻转培养基继续培养。第1周每3天换液1次,以后每2天换液1次。

1.4　白蛋白分泌的检测

换液时收集培养液,离心去除浮游单个细胞及碎片,以溴甲酚绿法检测上清液中白蛋白含量。

2　结 果

2.1　细胞形态及生长动态

培养1周后组织块周围有少数细胞长出, 10天后细胞生长速度较快,大部分组织块周围

①省教委资助课题

②　病毒基因工程研究室

的细胞呈放射状向四周扩散,多数细胞呈圆形,有些细胞有伪足,细胞界限清楚,25～30d细胞铺满瓶底,见图1、2。少数培养瓶组织块周围细胞以出芽的方式向外推进,细胞呈多边形,经一段时间培养后,细胞群中一些细胞相互分离卷曲,在细胞群中出现网眼状空洞

。图1　培养至第10天时的肝细胞(10×10

)

图2　培养至第20天时的肝细胞(20×10)

2.2　白蛋白分泌情况

从培养的第10天开始,培养物上清液中的白蛋白含量明显高于只有培养基而无肝细胞的空白对照瓶的白蛋白含量,在培养的第20天时培养物上清液中的白蛋白含量达高峰,以后白蛋白含量稍有下降,见表1。

表1　不同培养时期培养物上清液中白蛋白含量 g L 样本量第6天第10天第16天第20天第24天第28天空白对照50.64±0.050.64±0.050.68±0.040.68±0.040.66±0.030.66±0.03培养物100.71±0.121.02±0.181.10±0.141.312±0.161.30±0.121.16±0.14 t值1.586.218.7211.9215.9010.81

p值>0.05<0.01<0.01<0.01<0.01<0.01

3　讨 论

虽然两步胶原酶灌注法分离肝细胞所获细胞成活率高[2,5],单位肝组织所获细胞多,价格昂贵,操作步骤多,易于污染;肝细胞与非实质细胞共培养虽能使肝细胞的形态与功能维持较长时间[3],但因一单层细胞中生长有两种不同类型的细胞,不利于实验时观察毒物、药物等对肝细胞形态的影响;近期发展的双层凝胶技术,延长了肝细胞生存与分泌白蛋白的时间[2],但操作过程较为复杂。胰酶消化、组织块培养操作简单,价格低廉,对于大部分实验来说,完全可以获得足够多的细胞以满足实验的要求。

操作过程中,在胰酶消化前要用D2H ank s 液将血细胞清洗干净。培养后期细胞互相分离,出现网眼状空洞,可能与产生透明脂酸酶有关[4]。此次培养的细胞能分泌白蛋白,具有类似体内肝细胞的代谢功能[6],可用于肝细胞生理、药理学的研究。

参考文献

1　R eese JA,Byard JL.Iso lati on and cu ltu re of adu lt hepatocytes from liver b i op sies.In V itro,1981;

17:935

2　R yan C M,Carter EA,Jenk in s RL,et al.Iso lati on and long term cu ltu re of hum an hepatocytes.

Su rgery,1993;113(1):48

3　C lem en t B,Guguen Gu illouzo C,Camp i on JP,et al.L ong term cocu ltu res of adu lt hum an hepato2 cytes w ith rat liver ep ithelial cells:modu lati on of secreti on and accum u lati on of ex tracellu lar m ateri2 al.H epato logy,1984;4:373

4　鄂征主编.组织培养和分子细胞学技术.北京:北京出版社,1994:152

5　Gom ez L echon M J,L opez P,Donato T,et al.

Cu ltu re of hum an hepatocytes from s m all su rgical liver b i op sies b i ochem ical characterizati on and comparison w ith in vivo.In V itro Cell D ev B i o l, 1990;26:67

6　王英杰.大鼠肝细胞的微载体粘附培养.中华实验外科杂志,1997;14(1):61

(收稿时间:1998209210)

Isola tion and Culture of Parenchy ma l Cell from M ouse L iver

Chen M ingsh i,Chen X ing,L iu chuanai

(D ep a rt m en t of Ep id e m iology,H engy ang M ed ica l Colleg e,H engy ang,421001)

L iver tissues from K M mou se iso lated by0.1%tryp tic digesti on w ere cu ltu red in DM E M m edial.Cells w ere founded around the tisues after1w eek of cu ltu re.Cells covered all of cu ltu re p late after30days of cu ltu re.T he liver cells cou ld secret album in under these cu ltu re conditi on s.T he p roducti on of album in arrived at the h ighest level on20th day of cu ltu re

Key W ords　tryp tic;　hepatocytes;　iso lati on　cu ltu re