H7N9禽流感DNA疫苗的免疫保护效力研究

H7N9禽流感DNA疫苗的免疫保护效力研究
梁真洁; 陈化兰; 潘俊慧; 于晓菲; 陈普成; 曾显营; 柳金雄; 施建忠; 邓国华; 姜永萍【期刊名称】《《中国预防兽医学报》》
【年(卷),期】2019(041)009
【总页数】5页(P935-939)
【关键词】H7N9禽流感; DNA疫苗; 免疫; 保护效力
【作者】梁真洁; 陈化兰; 潘俊慧; 于晓菲; 陈普成; 曾显营; 柳金雄; 施建忠; 邓国华; 姜永萍
【作者单位】中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室哈
尔滨黑龙江150069
【正文语种】中文
【中图分类】S852.65
禽流感病毒(Avian influenza virus，AIV)能够感染包括家禽在内的多种鸟类，引
起其严重的致死性疾病。

H7N9 禽流感在2013年初引起多次人感染疫情，在2017年演变为高致病性禽流感，不仅引发了严重的人类公共卫生安全，也给养禽业造成了重大的经济损失[1]。

我国于2017年9 月在全国范围内进行了家禽
H7N9 疫苗免疫接种，极大地降低了家禽中H7N9 病毒的复制和传播，更有效阻
断了病毒由禽向人的传播。

但研究显示，新出现的H7N9 高致病性病毒进化迅速，已经发现在鸭子中新出现了具有致病性的H7N9 和H7N2 病毒，这为H7N9 禽流
感的防控带来了新的挑战[2-3]。

HA 蛋白是流感病毒囊膜纤突的重要组成部分，是其表面最重要的糖蛋白之一。

它是流感病毒粒子表面最主要的成分，除了在与受体结合、融合、包装及致病性方面发挥重要作用外，还是宿主获得性免疫系统识别的主要对象。

流感病毒感染宿主后，会诱导其产生强烈的免疫反应，导致中和抗体的产生[4]。

因此，HA 蛋白是流感
病毒疫苗研制的主要靶抗原。

禽流感防控实践表明，疫苗免疫是最有效的防控禽流感的措施之一。

禽流感DNA 疫苗较传统疫苗相比具有许多优点：疫苗的制备工艺简单，便于大批量生产；质粒DNA 在2 ℃～8 ℃性能稳定，便于运输和储存；免疫原性强，能够同时激活细胞免疫和体液免疫；仅表达HA 基因，免疫后能够与感染鸡进行鉴别，不影响疾病
的流行病学普查。

因此很有必要研制H7N9 DNA 疫苗，为H7N9 禽流感的防控
提供有益和必要的技术支撑[5]。

本研究首先构建含H7N9 AIV HA 的重组质粒，
并对其进行IFA和western blot 鉴定，最后经动物实验来评价该质粒的免疫效力。

为H7N9 的防控提供良好的物质基础。

1 材料与方法
1.1 质粒、病毒株和细胞系 pCAGGs 载体、攻毒用高致病性AIV
(HPAIV)CK/GX/SD098/17 (H7N9)株和低致病性AIV
(LPAIV)CK/CQ/SD057/17(H7N9)株及其标准抗原和相对应的鸡抗H7N9 AIV 多
克隆抗体、293T 细胞均由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所国家禽流感参考实验室保存；E.coli DH5α 感受态细胞购自北京TransGen 公司。

1.2 主要试剂 Q5 高保真酶和内切酶EcoRⅠ/Xho Ⅰ购自 NEB 公司；Lipofectamine 3000 LTX 转染试剂购自Invitrogen 公司；兔抗鸡IgG-FITC 荧光二抗购自life 公司；兔抗GAPDH 单克隆抗体(MAb)购自Santa CruzBiotechnology 公司；驴抗鸡 Ig (H+L)-Dlight800 抗体购自Odyssey 公司；
引物由库美公司合成。

1.3 H7N9 AIV HA 基因重组表达质粒的构建与鉴定将H7N9 AIV HA 基因的密码子优化为鸡体所偏嗜的密码子，并由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

优化的HA 基因经EcoRⅠ/Xho Ⅰ双酶切后定向克隆至pCAGGs 载体，构建的重组质粒
采用载体引物进行PCR 鉴定，采用EcoRⅠ/Xho Ⅰ、Xho Ⅰ以及pstⅠ酶切鉴定且测序鉴定后，命名为pCASD098。

1.4 H7N9 AIV HA 蛋白的间接免疫荧光检测(IFA) 待293T 细胞状态良好、密度约为8×105 个/mL 时，用Lipofectamine 3000 转染重组质粒pCA-SD098，并同时设立载体质粒pCAGGS 对照组。

转染48 h，经固定处理后，以鸡抗H7N9 AIV 多克隆抗体(1∶300)为一抗，兔抗鸡IgG-FITC (1∶1 000)为二抗，经IFA检测
H7N9 AIV HA 蛋白的表达情况。

1.5 H7N9 AIV HA 蛋白的western blot 鉴定将重组质粒pCA-SD098 及对照质
粒pCAGGs 分别转染状态良好、密度约为8×105 个/mL 的293T 细胞，同样用Lipofectamine 3000 转染 293T 细胞，转染 48 h 后收集样品，经RIPA 裂解，
以H7N9 AIV 多克隆抗体(1∶500)为一抗，以驴抗鸡 IgG-Dlight800 (1∶5 000)
为二抗， western blot 鉴定HA 蛋白的表达情况，并以GAPDH 的表达作为
293T 细胞基因正常表达的对照。

1.6 重组质粒pCA-SD098 的免疫效力评价
1.6.1 SPF 鸡的免疫试验设计将重组质粒pCA-SD098 以肌肉注射方式免疫3 周
龄SPF 鸡，免疫以及分组情况见表1，并在首次免疫后每周采集免疫及对照鸡血，用红细胞凝集抑制试验(HI)检测其中的HI 抗体水平。

表1 SPF 鸡的免疫分组情况Table 1 The groups of immunized SPF chickens
组别Groups 1 2 3 4 5疫苗Vaccine pCA-SD098 PBS pCA-SD098 pCA-SD098 PBS免疫剂量(/ 只)Dose 15 μg 0.2mL 15 μg 20 μg 0.2 mL SPF 鸡数No.of SPF
chickens 10 7 10 10 7免疫时间Inoculation time首次免疫：3 周龄；加强免疫：首次免疫后21 d Vaccination: at the age of three weeks;Booster: 21 days post vaccination攻毒病毒株Challenge virus
CK/GX/SD098/17(H7N9)CK/GX/SD098/17(H7N9)CK/CQ/SD057/17(H7N9)C K/CQ/SD057/17(H7N9)CK/CQ/SD057/17(H7N9)攻毒时间Challenge time首次免疫后28 d 28 days post vaccinatin
1.6.2 攻毒保护实验加强免疫一周后，分别经鼻腔途径感染105 EID50
CK/GX/SD098/17 (H7N9)和CK/CQ/SD057/17 (H7N9)，攻毒之后的观察期为10 d，每天查看和记录免疫鸡以及对照鸡的发病和死亡情况。

1.6.3 病毒的分离攻毒后第3 d、第5 d 和第7 d无菌采集所有SPF 鸡喉头和泄殖腔拭子，并用加双抗的PBS 做10 倍倍比稀释，每个稀释度接种3 枚10 日龄SPF 鸡胚，48 h 之后，检测SPF 鸡胚尿囊液的HA 效价，并按照Reed&Muench 法
计算分离病毒的滴度。

2 结果
2.1 重组质粒pCA-SD098 的构建及鉴定利用双酶切以及定向克隆的方法构建了
重组质粒pCA-SD098。

将重组质粒pCA-SD098 使用载体引物进行PCR 鉴定，
结果显示所得条带均正确(图1)，并且测序结果与预期完全符合。

表明正确构建了
重组质粒pCA-SD098。

2.2 目的蛋白表达的IFA 检测结果将重组质粒pCA-SD098、空载体 pCAGGs 转
染 293T 细胞 48 h之后，通过IFA 检测目的蛋白的表达。

结果显示，pCA-
SD098 转染的细胞有绿色荧光，而空载体无绿色荧光(图2)，表明H7N9 HA 蛋白在 293T 细胞中得到了表达。

图1 重组质粒pCA-SD098 的PCR 鉴定Fig.1 Identification of pCA-SD098 by PCRM: DL8000 DNA Marker; 1: PCR products of pCA-SD098;2: PCR
products of pCAGGs; 3: Negtive control;4: pCA-SD098
图2 HA 蛋白在293T 细胞中表达的 IFA 检测Fig.2 Identification of the expressed HA in 293T cells by IFAA: The 293T cells transfected with pCA-
SD098;B: The 293T cells transfected with pCAGGs
2.3 目的蛋白表达的western blot 鉴定将重组质粒pCA-SD098、空载体pCAGGs 转染293T 细胞48 h之后进行western blot 鉴定。

结果显示，在约73 ku处有特异性条带，与预期HA 蛋白大小相符，对照组无该条带(图3)。

表明，HA 蛋白在293T 细胞中得到了表达，且该蛋白具有较好的反应原性。

图3 目的蛋白在293T 细胞中表达的western blot 鉴定Fig.3 Identification of expressed HA protein by western blot1, 3: The 293T cells transfected with pCA-SD098;2, 4: The 293T cells transfected with pCAGGs
2.4 重组质粒pCA-SD098 的免疫效力评价
2.4.1 重组质粒免疫以及攻毒后的SPF 鸡HI 抗体水平的检测结果加强免疫前，免疫鸡产生的HI抗体水平相对比较低。

加强免疫后一周，15 μg/ 只免疫鸡的HI 抗体水平最高可达到1∶32；20 μg/只免疫鸡产生的HI 抗体水平最高可达到1∶64。

在攻毒后，所有免疫鸡的HI 抗体水平显著上升(图4)。

表明重组质粒pCA-SD098 免疫后可以诱导SPF 鸡产生较高水平的HI 抗体，且20 μg/ 只免疫SPF 鸡诱导的HI 抗体水平高于15 μg/ 只免疫SPF 鸡诱导的HI抗体水平。

图4 免疫鸡HI 抗体检测结果Fig.4 HI antibodies induced by pCA-SD098
2.4.2 攻毒后SPF 鸡发病、死亡情况与病毒分离首次免疫后28 d，用致死剂量
105 EID50 的HPAIV CK/GX/SD098/17(H7N9)攻毒后，所有免疫鸡无发病，无
死亡，无排毒，而对照组鸡在攻毒后均有排毒并在攻毒后6 d 内全部死亡。

在用LPAIV CK/CQ/SD057/17(H7N9)攻毒后，免疫15 μg/ 只pCA-SD098 组有少数鸡可检测到排毒，但均无发病、无任何临床症状，20 μg/ 只免疫组鸡在攻毒
后均无发病、无排毒，对照组鸡可见眼睑肿胀，且均排毒(表2)。

上述结果表明，
重组质粒pCA-SD098 15 μg/ 只免疫鸡可以使其对致死性同源病毒的攻击提供100 %的保护，重组质粒20 μg/ 只免疫鸡可以使其对异源病毒的攻击提供100 %的保护。

表2 SPF 鸡攻击H7N9 AIV 后的排毒检测结果Table 2 Virus shedding from SPF chickens infected with H7N9 AIV§：对照鸡在病毒攻击后6 d 内全部死亡。

§: The chicken died in six days post challe nge.pCA-SD098剂量/ 攻毒病毒株Dose/Virus strains used for challenge阳性数/ 存活数(滴度)Virus
shedding/survivors (Titer log EID50)第3 d Day 3第5 d Day 5第7 d Day 7 15 μg/[CK/GX/SD098/17(H7N9)]PBS/[CK/GX/SD098/17(H7N9)]15
μg/[CK/CQ/SD057/17(H7N9)]20
μg/[CK/CQ/SD057/17(H7N9)]PB S/[CK/CQ/SD057/17(H7N9)]喉头Oropharyngeal 0/10 6/7 (2.5±1.7)4/10 (2.7±0.4)0/10 7/7 (2.2±0.7)泄殖腔Cloacal 0/10 7/7 (2.0±0.7)0/10 0/10 0/7喉头Oropharyngeal 0/10 7/7
(4.2±1.5)2/10 (1.7±1.1)0/10 4/7 (1.7±1.6)泄殖腔Cloacal 0/10 7/7
(2.5±1.3)0/10 0/10 0/7喉头Oropharyngeal 0/10§1/10 （0.9）0/10 2/7 (0.5±0.9)泄殖腔Cloacal 0/10§0/10 0/10 0/7
3 讨论
2013年初，我国发生人感染H7N9 流感病毒的疫情，并在2013年～2018年间
连续引起了5 波感染人的疫情。

2017年发现H7N9 病毒在HA 基因的裂解位点
插入了4 个碱性氨基酸，使得H7N9 AIV由不引起家禽发病的低致病性病毒演变
为高致病性病毒，并相继在家禽中引起了8 起疫情[2-3]。

不仅引发了严重的人类
公共卫生安全，也给养禽业造成了重大的经济损失[6-7]。

因此，H7N9 禽流感的
防控具有很大的挑战性。

自2017年9 月份以来，全国范围内H5/H7 二价灭活疫
苗免疫的普及，有效阻断了H7N9 病毒在家禽中的流行，降低了活禽市场和养殖场H7N9 病毒的污染面和污染程度，从而阻断了人感染H7N9 病例的发生[8-9]。

DNA 疫苗作为新型的疫苗逐步走入市场，本实验前期已构建含鸡偏嗜性密码子的H5 亚型AIV HA基因表达载体，这一重组质粒免疫SPF 鸡后能够诱导其产生高水平的HI 抗体[10-12]。

本研究按照鸡的偏嗜性对HPAIV SD098 (H7N9)株的HA 基因进行优化并合成，同时将HA 片段插入到pCAGGs 载体中，构建了重组质粒pCA-SD098。

将重组质粒pCA-SD098 转染293T 细胞，通过IFA 和 western blot 检测到HA 蛋白能够在 293T 细胞中瞬时表达，且表达的HA 蛋白具有良好的反应原性，可以作为靶抗原为后续的动物实验提供保护。

为评价pCA-SD098 的免疫保护效果，本研究进行了动物免疫保护实验，将该质粒以15 μg/ 只免疫SPF 鸡后，其可以抵御致死剂量的同源HPAIV
CK/GX/SD098/17 (H7N9)病毒的攻击，但仅能降低异源LPAIV
CK/CQ/SD057/17 (H7N9)感染后的病毒载量；以20 μg/只的剂量免疫后，可以有效阻止异源LPAIV CK/CQ/SD057/17 (H7N9)在鸡体内的复制。

表明构建的质粒DNA 对亲本病毒可以提供100 %的保护，并对异源病毒可以提供交叉保护。

DNA 疫苗是未来人和动物预防与治疗相关疫病的重要技术发展方向之一，当DNA 疫苗通过肌肉注射的方式进入鸡体内，肌细胞就会表达目的蛋白并释放相应的抗原多肽。

该抗原被抗原提呈细胞(APC)吞噬并递呈给MHCⅠ类和MHCⅡ类分子，从而启动CD8+ T 和CD4+ T 淋巴细胞[13]，诱导全面的体液和细胞免疫反应。

因此，本研究构建的H7N9 禽流感DNA 疫苗可以作为防控H7N9 AIV 的候选疫苗之一。

【相关文献】
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