大肠杆菌检测方法步骤

饮用水中大肠杆菌及检测方法

一、乳糖发酵实验（初发酵实验）

溶液与试剂：

乳糖胆盐发酵管

成分：蛋白胨20g，猪胆盐5g，乳糖10g，0.04%溴甲酚紫水溶液25mL，蒸馏水1000mL，pH7.4。（乳糖胆盐培养基取30g，溶于1000mL纯水中即可）

操作步骤

1：将配制好的培养液，分装于每管10mL，共装9个试管，并各放入一个小倒管，115℃高压灭菌15min。

2：水样稀释

（1）无菌操作取水样1 mL放于含9mL的灭菌生理盐水中，置于容量瓶中，震荡摇匀为1:10的稀释液。取上述稀释液1mL，注入9mL灭菌生理盐水，震荡摇匀，为1:100的稀释液。（2）取水样，1:10稀释液，1：100稀释液各1mL接种到乳糖胆盐发酵管中。（根据检样的污染程度可以适当调整稀释的比例）每一稀释度接种三管。

3：将试管连同试管架放入培养箱中37℃左右培养24h。

产酸溶液会由紫色变为黄色，产气发酵管中会有气泡。如所有乳糖胆盐发酵管都不产气，则报告大肠杆菌群阴性，如有产气管，就需要进行分离培养，即进行伊红美蓝培养基鉴别实验。

二、伊红美蓝培养基鉴别实验（接种实验）

伊红美蓝琼脂（EMB)

成分：蛋白胨10g，乳糖10g，磷酸氢二钾2g，琼脂17g，2%伊红溶液20mL。0.65%美蓝溶液10mL，蒸馏水1000L，pH7.1.

制法：将蛋白胨，磷酸盐和琼脂溶解于蒸馏水中，校正pH，分装于烧瓶内，121℃高压灭菌15min，备用。临用时加入乳糖，并加热融化琼脂，冷至50~55℃，加入伊红美蓝溶液，摇匀，倾注平板。

操作步骤

1称量：准确称取各成分。

2 溶化：加热熔化，定容。

3 调pH：用1mol/L NaOH溶液调节pH至偏碱性。

4 灭菌：将两个500ml的三角瓶中加上棉塞。将培养皿用报纸包好，放入灭菌锅内，121℃高压灭菌15min。

5 倒平板（均在无菌台中操作）：灭菌后，待固体培养基冷却至60℃左右时在酒精灯火焰附近操作进行。其过程是：

①将灭过菌的培养皿放在火焰旁，右手拿装有培养基的三角瓶，左手拔出棉塞；

②右手拿三角瓶，使三角瓶的瓶口迅速通过火焰；

③用左手将培养皿打开一条稍大于三角瓶口的缝隙，右手将培养基倒入培养皿，立刻盖上皿盖；

④待平板冷却凝固后，将平板倒过来放置。

倒过来放置的目的是防止培养基冷却过程中形成的水滴落到培养基表面。向培养皿中转移已灭菌的培养基时，也不要把培养基沾在皿壁上。否则，空气中杂菌会在这些粘附培养基上繁殖，并污染皿内培养基。

6 接种：

将之前产气的发酵管分别接种在伊红美蓝琼脂平板上

划线分离法：用接种环蘸菌液后在含有固体培养基的培养皿平板上划线，在划线过程中菌液逐渐减少，细菌也逐渐减少。划线到最后，可使细菌间的距离加大。

7 细菌培养：将接种好的培养皿放入培养箱中37℃、培养20~24小时。观察菌落形态。

大肠杆菌在伊红美蓝琼脂培养基上呈现深黑紫色，且有金属光泽菌落。

证实实验：

在上述平板上，挑取可疑大肠杆菌1~2个进行革兰氏染色，同时接种乳糖发酵管，置（36±1）℃恒温培养箱培养（24±2）h，观察产气情况。凡乳糖管产气，革兰氏染色为阴性的无芽孢杆菌，即可报告大肠杆菌阳性。

三、革兰氏染色镜检实验

1 溶液与试剂

无菌生理盐水，草酸铵结晶紫染液，卢戈氏碘液，95%乙醇，番红复染夜，香柏油，二甲苯（或成品革兰氏染液）

2 仪器

酒精灯，载玻片，显微镜，两个长铁条（做架子用），接种环，滴管、吸水纸等

3 染色

初染：滴加草酸结晶紫染液覆盖涂菌部位，染色2min，水洗至流出水无色。

媒染：用卢戈氏染液冲去残留水迹，再用碘液覆盖1min，倾去碘液，水洗至流出水无色。

脱色：将玻片上的水用吸水纸吸取，用滴管流加95%乙醇脱色（持续20秒），稍后立即洗去乙醇。

复染：将玻片上的水用吸水纸吸去，用番红复染液染色2min，水洗，吸去残水烤干。

4镜检

分别用香柏油覆盖涂菌部位，先用低倍镜找到菌，换用的物镜观察染色情况。观察结束后，用二甲苯擦洗镜头。

备注：大肠杆菌是一种能发酵乳糖、产酸产气和兼性厌氧的革兰氏阴性菌，革兰氏染色呈红色。

报告

根据证实为大肠杆菌阳性的管数，查MPN检索表，报告每100mL检样的大肠杆菌的最可能数。