实验一蛋白质变性凝固及沉淀(WT)
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实验一
蛋白质的变性、凝固及沉淀 蛋白质的变性、
生物化学与分子生物学教研室
实验目的
能够说出蛋白质变性、凝固反应的原理及实验方法 能够说出蛋白质变性、 能够说出蛋白质沉淀反应的原理及实验方法 能够运用盐析法及重金属沉淀法
主要实验内容
蛋白质的加热变性凝固 蛋白质沉淀反应
蛋白质盐析 重金属盐沉淀蛋白质 生物碱试剂沉淀蛋白质
蛋白质沉淀反应
生物碱试剂沉淀蛋白质
在酸性条件下，蛋白质可与生物碱试剂 如苦味酸 如苦味酸、 在酸性条件下，蛋白质可与生物碱试剂(如苦味酸、 钨酸、鞣酸)以及某些酸 如三氯醋酸、过氯酸、 以及某些酸(如三氯醋酸 钨酸、鞣酸 以及某些酸 如三氯醋酸、过氯酸、硝 结合成不溶性的盐沉淀， 酸)结合成不溶性的盐沉淀，此时蛋白质带正电荷 结合成不溶性的盐沉淀 易于与酸根负离子结合成盐。 易于与酸根负离子结合成盐。
蛋白质沉淀反应
重金属盐沉淀蛋白质
在碱性条件下， 在碱性条件下，重金属离子与蛋白质结合成不溶 性蛋白盐而沉淀。 性蛋白盐而沉淀。
实验内容
取一只小玻璃试管，加入1mL蛋白质溶液； 蛋白质溶液； ① 取一只小玻璃试管，加入 蛋白质溶液 加入0.1mol/mL NaOH 2d，混匀； ② 加入 ，混匀； ③ 逐滴加入CuSO4，摇匀，直至出现沉淀为止。 逐滴加入 摇匀，直至出现沉淀为止。
蛋白质的加热变性凝固
蛋白质分子受热作用，分子空间结构变化， 蛋白质分子受热作用，分子空间结构变化，疏 水基团暴露于分子表面，溶解度降低。 水基团暴露于分子表面，溶解度降低。 当蛋白质分子不带电荷（处于等电点条件下）， 当蛋白质分子不带电荷（处于等电点条件下）， 不带电荷 等电点条件下 则蛋白质发生聚集出现沉淀 出现沉淀； 则蛋白质发生聚集出现沉淀； 当蛋白质分子带电（处于非等电点条件下）， 当蛋白质分子带电（处于非等电点条件下）， 分子带电 非等电点条件下 不出现沉淀； 则蛋白质因静电排斥作用而不出现沉淀 则蛋白质因静电排斥作用而不出现沉淀；
④ 向3号管中加入： 0.1mol/L NaOH 。一旦出现絮状物 号管中加入： 号管中加入 即停止。 即停止。 号管于酒精灯上加热 ⑤ 将3号管于酒精灯上加热，观察现象（ 号管于酒精灯上加热，观察现象（ ） ⑥ 冷却后，再加入： 0.1mol/L NaOH 2d。观察现象 冷却后，再加入： 。 ） （
实验内容
取一只小玻璃试管，加入2mL蛋白质溶液； 蛋白质溶液； ① 取一只小玻璃试管，加入 蛋白质溶液 饱和(NH4)2SO4溶液，混匀后静置 溶液，混匀后静置3min。 加入等体积饱和 。 ② 加入等体积饱和 观察现象（ 观察现象（ ） ③ 对该溶液进行过滤，将滤液收集于一只干净试管中， 对该溶液进行过滤，将滤液收集于一只干净试管中， 取部分转入另一只试管中； 取部分转入另一只试管中； 结晶(NH4)2SO4粉末，直到粉末不 粉末， 向一只试管中加入结晶 ④ 向一只试管中加入结晶 再溶解（成为饱和 饱和(NH4)2SO4溶液）； 溶液）； 再溶解（成为饱和 比较两只试管现象（ ⑤ 比较两只试管现象（ ）
蛋白质的沉淀
结构和性质都不变 适当条件下可重新溶解 是分离和纯化的基本方法 结构和性质都发生变化
沉淀不再溶解于水
蛋白质的凝固
蛋白质变性沉淀并凝聚成块状称为凝固。 蛋白质变性沉淀并凝聚成块状称为凝固。 凝固 不可逆变性状态
蛋白质变性、 蛋白质变性、沉淀与凝固的关系
变性属于蛋白质本质的变化， 变性属于蛋白质本质的变化，沉淀和凝固属于 一种现象 变性不一定沉淀， 变性不一定沉淀，变性蛋白质只在等电点附近 才沉淀 变性蛋白易于沉淀， 变性蛋白易于沉淀， 沉淀蛋白不一定变性 沉淀的变性蛋白质也不一定凝固
蛋白质变性不一定出现沉淀； 蛋白质变性不一定出现沉淀； 蛋白质变性后在特定条件下发生沉淀，并可逆； 蛋白质变性后在特定条件下发生沉淀，并可逆；
蛋白质沉淀反应
蛋白质的盐析 蛋白质的盐析
一定浓度中性盐 （ (NH4)2SO4、Na2SO4等）可去 除蛋白质分子所带电荷及其表面的水化层， 除蛋白质分子所带电荷及其表面的水化层，从而使 蛋白质从溶液中聚集沉淀出来。 蛋白质从溶液中聚集沉淀出来。利用这个原理使蛋 白质从溶液中沉淀出来的方法为盐析 盐析。 白质从溶液中沉淀出来的方法为盐析。 不同蛋白质盐析时所需的盐浓度不同， 不同蛋白质盐析时所需的盐浓度不同，可以通过 不同浓度盐溶液分离不同蛋白质，就是分段盐析 分段盐析。 不同浓度盐溶液分离不同蛋白质，就是分段盐析。 大部分蛋白质都可用饱和 溶液盐析出来。 大部分蛋白质都可用饱和(NH4)2SO4溶液盐析出来。 饱和 某些蛋白质在半饱和 溶液中析出。 某些蛋白质在半饱和(NH4)2SO4溶液中析出。 半饱和 盐析是一个可逆沉淀反应。 盐析是一个可逆沉淀反应。 可逆沉淀反应
③ 冷却后，再加入： 0.1mol/L HCl 2d。观察现象 冷却后，再加入： 。 （ ）
蛋白质变性不一定出现沉淀； 蛋白质变性不一定出现沉淀； 蛋白质变性后在特定条件下发生沉淀； 蛋白质变性后在特定条件下发生沉淀； 沉淀加热后发生不可逆变性并凝固。 沉淀加热后发生不可逆变性并凝固。
3. 向3号管中加入：H2O 8d, 0.1mol/L NaOH 2d。混匀， 号管中加入 号管中加入： 。混匀， 于酒精灯上缓慢加热至沸点，观察变化（ 于酒精灯上缓慢加热至沸点，观察变化（ ）；
实验内容
取三只小玻璃试管，各加入 蛋白质溶液10d， 取三只小玻璃试管，各加入10%蛋白质溶液 蛋白质溶液 ， 分别标记为1、 和 号管 号管； 分别标记为 、2和3号管；
1. 向1号管中加入：pH4.8缓冲液 号管中加入 缓冲液10d 。混匀，于酒精灯 混匀， 号管中加入： 缓冲液 上缓慢加热至沸点，观察变化（ 上缓慢加热至沸点，观察变化（ ）；
蛋白质的变性 (denaturation)
在某些理化因素的作用下， 在某些理化因素的作用下，蛋白质严格的空间结构 被破坏（不包括肽键的断裂），从而引起若干理化性质 被破坏（不包括肽键的断裂），从而引起若干理化性质 ）， 和生物学性质改变的现象。 和生物学性质改变的现象。
变性后的蛋白质称变性蛋白 能使蛋白质变性 变性后的蛋白质称变性蛋白,能使蛋白质变性 变性蛋白 的物质叫蛋白质变性剂 蛋白质变性剂。 的物质叫蛋白质变性剂。
变性的可逆性
可逆变性：除去变性因素， 可逆变性：除去变性因素，蛋白质空间结构可 以恢复原状。 以恢复原状。 不可逆变性：除去变性因素， 不可逆变性：除去变性因素，蛋白质空间结构 不能恢复原状。 不能恢复原状。
消灭病原微生物 蛋白质制剂的保存 保护体内蛋白质
蛋白质的胶体性质及沉淀: 蛋白质的胶体性质及沉淀:
蛋白质分子颗粒大小1-100nm之间 属胶体颗 之间,属胶体颗 蛋白质分子颗粒大小 之间 粒范围，在溶液中能形成稳定的胶体。 粒范围，在溶液中能形成稳定的胶体。 表面形成水化层
+ + + + + + + +
原因 表面同种电荷的斥力
除去这两个因素，就会发生沉淀。 除去这两个因素，就会发生沉淀。蛋白质分 子相互聚集而从溶液中析出的现象称为沉淀 沉淀。 子相互聚集而从溶液中析出的现象称为沉淀。
实验内容
取一只小玻璃试管，加入1mL蛋白质溶液； 蛋白质溶液； ① 取一只小玻璃试管，加入 蛋白质溶液 ，观察现象（ ② 加入饱和苦味酸 6d，观察现象（ ）； 注意：苦味酸属危险试剂， 注意：苦味酸属危险试剂，操作时勿接触皮肤
实验记录与实验报告
⑴ 实验目的； 实验目的； 实验原理； ⑵ 实验原理； 仪器、材料和试剂； ⑶ 仪器、材料和试剂； 实验步骤； ⑷ 实验步骤； 结果讨论（含数据处理）； ⑸ 结果讨论（含数据处理）；
号管中 加入： 停止加热， 号管 逐滴加入 。 ① 停止加热，向3号管中逐滴加入：0.1mol/L HAC。一 旦出现絮状物即停止。 旦出现絮状物即停止。 继续滴加： ② 继续滴加：0.1mol/L HAC 1d。观察现象（ 。观察现象（ ③ 将3号管于酒精灯上加热，观察现象（ 号管于酒精灯上加热，观察现象（ 号管于酒精灯上加热 ） ）
+ + + + +
+ + +
-
-
酸 碱 碱
在等电点的蛋白质 （亲水胶体） -
酸
带正电荷的蛋白质 （亲水胶体）
带负电荷的蛋白质 （亲水胶体） 脱水
脱水 脱水
酸
+ + + + + 带正电荷的蛋白质 （沉淀） + 不稳定的蛋白质颗粒
碱
+ +
- - - 带负电荷的蛋白质 （疏水胶体）
（疏水胶体）
蛋白质胶体颗粒的沉淀
高温、 高温、高压
物理因素 变性因素
紫外线、 射线 射线、 紫外线、X射线、 电离辐射和超声波等 强酸、强碱 强酸、
化学因素
有机溶剂、 有机溶剂、重金属盐 高浓度尿素、 高浓度尿素、盐酸胍等
变性实质： 变性实质：
破坏了空间结构，一级结构不受影响（分子组成、 破坏了空间结构，一级结构不受影响（分子组成、 分子量不变）。 分子量不变）。
高温下，蛋白质发生不可逆的Leabharlann Baidu性并凝固。 高温下，蛋白质发生不可逆的变性并凝固。
2. 向2号管中加入：H2O 8d, 0.1mol/L HCl 2d。混匀， 号管中加入 号管中加入： 。混匀， 于酒精灯上缓慢加热至沸点，观察变化（ 于酒精灯上缓慢加热至沸点，观察变化（ ）
号管中 加入： 停止加热， ① 停止加热，向2号管中逐滴加入：0.1mol/L NaCO3 。 号管 逐滴加入 摇匀后继续滴加，一旦出现絮状物即停止。 摇匀后继续滴加，一旦出现絮状物即停止。 号管于酒精灯上加热 ② 将2号管于酒精灯上加热，观察现象（ 号管于酒精灯上加热，观察现象（ ）
蛋白质的变性、凝固及沉淀 蛋白质的变性、
生物化学与分子生物学教研室
实验目的
能够说出蛋白质变性、凝固反应的原理及实验方法 能够说出蛋白质变性、 能够说出蛋白质沉淀反应的原理及实验方法 能够运用盐析法及重金属沉淀法
主要实验内容
蛋白质的加热变性凝固 蛋白质沉淀反应
蛋白质盐析 重金属盐沉淀蛋白质 生物碱试剂沉淀蛋白质
蛋白质沉淀反应
生物碱试剂沉淀蛋白质
在酸性条件下，蛋白质可与生物碱试剂 如苦味酸 如苦味酸、 在酸性条件下，蛋白质可与生物碱试剂(如苦味酸、 钨酸、鞣酸)以及某些酸 如三氯醋酸、过氯酸、 以及某些酸(如三氯醋酸 钨酸、鞣酸 以及某些酸 如三氯醋酸、过氯酸、硝 结合成不溶性的盐沉淀， 酸)结合成不溶性的盐沉淀，此时蛋白质带正电荷 结合成不溶性的盐沉淀 易于与酸根负离子结合成盐。 易于与酸根负离子结合成盐。
蛋白质沉淀反应
重金属盐沉淀蛋白质
在碱性条件下， 在碱性条件下，重金属离子与蛋白质结合成不溶 性蛋白盐而沉淀。 性蛋白盐而沉淀。
实验内容
取一只小玻璃试管，加入1mL蛋白质溶液； 蛋白质溶液； ① 取一只小玻璃试管，加入 蛋白质溶液 加入0.1mol/mL NaOH 2d，混匀； ② 加入 ，混匀； ③ 逐滴加入CuSO4，摇匀，直至出现沉淀为止。 逐滴加入 摇匀，直至出现沉淀为止。
蛋白质的加热变性凝固
蛋白质分子受热作用，分子空间结构变化， 蛋白质分子受热作用，分子空间结构变化，疏 水基团暴露于分子表面，溶解度降低。 水基团暴露于分子表面，溶解度降低。 当蛋白质分子不带电荷（处于等电点条件下）， 当蛋白质分子不带电荷（处于等电点条件下）， 不带电荷 等电点条件下 则蛋白质发生聚集出现沉淀 出现沉淀； 则蛋白质发生聚集出现沉淀； 当蛋白质分子带电（处于非等电点条件下）， 当蛋白质分子带电（处于非等电点条件下）， 分子带电 非等电点条件下 不出现沉淀； 则蛋白质因静电排斥作用而不出现沉淀 则蛋白质因静电排斥作用而不出现沉淀；
④ 向3号管中加入： 0.1mol/L NaOH 。一旦出现絮状物 号管中加入： 号管中加入 即停止。 即停止。 号管于酒精灯上加热 ⑤ 将3号管于酒精灯上加热，观察现象（ 号管于酒精灯上加热，观察现象（ ） ⑥ 冷却后，再加入： 0.1mol/L NaOH 2d。观察现象 冷却后，再加入： 。 ） （
实验内容
取一只小玻璃试管，加入2mL蛋白质溶液； 蛋白质溶液； ① 取一只小玻璃试管，加入 蛋白质溶液 饱和(NH4)2SO4溶液，混匀后静置 溶液，混匀后静置3min。 加入等体积饱和 。 ② 加入等体积饱和 观察现象（ 观察现象（ ） ③ 对该溶液进行过滤，将滤液收集于一只干净试管中， 对该溶液进行过滤，将滤液收集于一只干净试管中， 取部分转入另一只试管中； 取部分转入另一只试管中； 结晶(NH4)2SO4粉末，直到粉末不 粉末， 向一只试管中加入结晶 ④ 向一只试管中加入结晶 再溶解（成为饱和 饱和(NH4)2SO4溶液）； 溶液）； 再溶解（成为饱和 比较两只试管现象（ ⑤ 比较两只试管现象（ ）
蛋白质的沉淀
结构和性质都不变 适当条件下可重新溶解 是分离和纯化的基本方法 结构和性质都发生变化
沉淀不再溶解于水
蛋白质的凝固
蛋白质变性沉淀并凝聚成块状称为凝固。 蛋白质变性沉淀并凝聚成块状称为凝固。 凝固 不可逆变性状态
蛋白质变性、 蛋白质变性、沉淀与凝固的关系
变性属于蛋白质本质的变化， 变性属于蛋白质本质的变化，沉淀和凝固属于 一种现象 变性不一定沉淀， 变性不一定沉淀，变性蛋白质只在等电点附近 才沉淀 变性蛋白易于沉淀， 变性蛋白易于沉淀， 沉淀蛋白不一定变性 沉淀的变性蛋白质也不一定凝固
蛋白质变性不一定出现沉淀； 蛋白质变性不一定出现沉淀； 蛋白质变性后在特定条件下发生沉淀，并可逆； 蛋白质变性后在特定条件下发生沉淀，并可逆；
蛋白质沉淀反应
蛋白质的盐析 蛋白质的盐析
一定浓度中性盐 （ (NH4)2SO4、Na2SO4等）可去 除蛋白质分子所带电荷及其表面的水化层， 除蛋白质分子所带电荷及其表面的水化层，从而使 蛋白质从溶液中聚集沉淀出来。 蛋白质从溶液中聚集沉淀出来。利用这个原理使蛋 白质从溶液中沉淀出来的方法为盐析 盐析。 白质从溶液中沉淀出来的方法为盐析。 不同蛋白质盐析时所需的盐浓度不同， 不同蛋白质盐析时所需的盐浓度不同，可以通过 不同浓度盐溶液分离不同蛋白质，就是分段盐析 分段盐析。 不同浓度盐溶液分离不同蛋白质，就是分段盐析。 大部分蛋白质都可用饱和 溶液盐析出来。 大部分蛋白质都可用饱和(NH4)2SO4溶液盐析出来。 饱和 某些蛋白质在半饱和 溶液中析出。 某些蛋白质在半饱和(NH4)2SO4溶液中析出。 半饱和 盐析是一个可逆沉淀反应。 盐析是一个可逆沉淀反应。 可逆沉淀反应
③ 冷却后，再加入： 0.1mol/L HCl 2d。观察现象 冷却后，再加入： 。 （ ）
蛋白质变性不一定出现沉淀； 蛋白质变性不一定出现沉淀； 蛋白质变性后在特定条件下发生沉淀； 蛋白质变性后在特定条件下发生沉淀； 沉淀加热后发生不可逆变性并凝固。 沉淀加热后发生不可逆变性并凝固。
3. 向3号管中加入：H2O 8d, 0.1mol/L NaOH 2d。混匀， 号管中加入 号管中加入： 。混匀， 于酒精灯上缓慢加热至沸点，观察变化（ 于酒精灯上缓慢加热至沸点，观察变化（ ）；
实验内容
取三只小玻璃试管，各加入 蛋白质溶液10d， 取三只小玻璃试管，各加入10%蛋白质溶液 蛋白质溶液 ， 分别标记为1、 和 号管 号管； 分别标记为 、2和3号管；
1. 向1号管中加入：pH4.8缓冲液 号管中加入 缓冲液10d 。混匀，于酒精灯 混匀， 号管中加入： 缓冲液 上缓慢加热至沸点，观察变化（ 上缓慢加热至沸点，观察变化（ ）；
蛋白质的变性 (denaturation)
在某些理化因素的作用下， 在某些理化因素的作用下，蛋白质严格的空间结构 被破坏（不包括肽键的断裂），从而引起若干理化性质 被破坏（不包括肽键的断裂），从而引起若干理化性质 ）， 和生物学性质改变的现象。 和生物学性质改变的现象。
变性后的蛋白质称变性蛋白 能使蛋白质变性 变性后的蛋白质称变性蛋白,能使蛋白质变性 变性蛋白 的物质叫蛋白质变性剂 蛋白质变性剂。 的物质叫蛋白质变性剂。
变性的可逆性
可逆变性：除去变性因素， 可逆变性：除去变性因素，蛋白质空间结构可 以恢复原状。 以恢复原状。 不可逆变性：除去变性因素， 不可逆变性：除去变性因素，蛋白质空间结构 不能恢复原状。 不能恢复原状。
消灭病原微生物 蛋白质制剂的保存 保护体内蛋白质
蛋白质的胶体性质及沉淀: 蛋白质的胶体性质及沉淀:
蛋白质分子颗粒大小1-100nm之间 属胶体颗 之间,属胶体颗 蛋白质分子颗粒大小 之间 粒范围，在溶液中能形成稳定的胶体。 粒范围，在溶液中能形成稳定的胶体。 表面形成水化层
+ + + + + + + +
原因 表面同种电荷的斥力
除去这两个因素，就会发生沉淀。 除去这两个因素，就会发生沉淀。蛋白质分 子相互聚集而从溶液中析出的现象称为沉淀 沉淀。 子相互聚集而从溶液中析出的现象称为沉淀。
实验内容
取一只小玻璃试管，加入1mL蛋白质溶液； 蛋白质溶液； ① 取一只小玻璃试管，加入 蛋白质溶液 ，观察现象（ ② 加入饱和苦味酸 6d，观察现象（ ）； 注意：苦味酸属危险试剂， 注意：苦味酸属危险试剂，操作时勿接触皮肤
实验记录与实验报告
⑴ 实验目的； 实验目的； 实验原理； ⑵ 实验原理； 仪器、材料和试剂； ⑶ 仪器、材料和试剂； 实验步骤； ⑷ 实验步骤； 结果讨论（含数据处理）； ⑸ 结果讨论（含数据处理）；
号管中 加入： 停止加热， 号管 逐滴加入 。 ① 停止加热，向3号管中逐滴加入：0.1mol/L HAC。一 旦出现絮状物即停止。 旦出现絮状物即停止。 继续滴加： ② 继续滴加：0.1mol/L HAC 1d。观察现象（ 。观察现象（ ③ 将3号管于酒精灯上加热，观察现象（ 号管于酒精灯上加热，观察现象（ 号管于酒精灯上加热 ） ）
+ + + + +
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酸 碱 碱
在等电点的蛋白质 （亲水胶体） -
酸
带正电荷的蛋白质 （亲水胶体）
带负电荷的蛋白质 （亲水胶体） 脱水
脱水 脱水
酸
+ + + + + 带正电荷的蛋白质 （沉淀） + 不稳定的蛋白质颗粒
碱
+ +
- - - 带负电荷的蛋白质 （疏水胶体）
（疏水胶体）
蛋白质胶体颗粒的沉淀
高温、 高温、高压
物理因素 变性因素
紫外线、 射线 射线、 紫外线、X射线、 电离辐射和超声波等 强酸、强碱 强酸、
化学因素
有机溶剂、 有机溶剂、重金属盐 高浓度尿素、 高浓度尿素、盐酸胍等
变性实质： 变性实质：
破坏了空间结构，一级结构不受影响（分子组成、 破坏了空间结构，一级结构不受影响（分子组成、 分子量不变）。 分子量不变）。
高温下，蛋白质发生不可逆的Leabharlann Baidu性并凝固。 高温下，蛋白质发生不可逆的变性并凝固。
2. 向2号管中加入：H2O 8d, 0.1mol/L HCl 2d。混匀， 号管中加入 号管中加入： 。混匀， 于酒精灯上缓慢加热至沸点，观察变化（ 于酒精灯上缓慢加热至沸点，观察变化（ ）
号管中 加入： 停止加热， ① 停止加热，向2号管中逐滴加入：0.1mol/L NaCO3 。 号管 逐滴加入 摇匀后继续滴加，一旦出现絮状物即停止。 摇匀后继续滴加，一旦出现絮状物即停止。 号管于酒精灯上加热 ② 将2号管于酒精灯上加热，观察现象（ 号管于酒精灯上加热，观察现象（ ）