第17章 体内药物分析简介

• 三、体内药物分析的对象和任务 • 分析物：主要生物样品中的药物、体内 代谢物、活性的代谢物、内源性物质 • 生物样品对象:人体和实验动物 • 生物样品种类:体液（血液、尿液、唾 液），另外还有头发和器官组织等。
• 体内药物分析的任务 1. 分析方法学的研究和完善 提供灵敏、专 属、准确的分析方法与最佳分析条件 2. 为药物体内研究提供数据 提供药物在动物和人体内的药物动力学 参数、 生物利用度及血浆蛋白结合率等基 本数据 3. 为临床治疗药物监测提供准确的血药浓度测 定值 —提供药学情报和信息,参与临床科学用药, 确 定最佳剂量,制定治疗方案.
• 二、分析方法的新要求 1. 检测方法的高灵敏度（最低检测量10-9~10-7g甚 至10-15~10-12g） 2. 分离方法的高选择性、高专属性 3. 分析方法应达到要求的精密度、准确度,具 有 稳定且较高的回收率 4. 求解出实验与临床上有意义的参数
体内药物分析的发展概况 及热点问题
• 一、体内药物分析的发展概况 20世纪60年代—临床药理学与生物药剂学的建立 70年代初—体内药物分析在国外开始建 70年代末—血药浓度监测广泛用于临床 80年代—体内药物分析学科日趋成熟 90年代—微量、超微量分离、分析技术应用
4. 体内内源性物质的测定和研究 氨基酸、 激素、肌酐、草酸、尿酸等在体内一定 浓度范围内含量变化指示机体病变 —为 某些疾病的诊断及治疗提供重要信息 5. 滥用药物的检测 —为吸毒者体内毒品和运动员体内禁药的 测定提供分析方法和可靠数据.
体内药物分析的特点与要求
• 一、体内药物分析的特点 1．干扰物质多 2．样品量少、不能重复取样 3．被测成分浓度低,对分析方法的灵敏度和专 属性要求较高. 4．有时需要测定缀合物和代谢产物. 5. 供药物浓度监测的分析方法要求简便、快速 ６.工作量大，要有一定的仪器设备
• 血清的制备 采集的静脉血液置试管中，于37℃或室 温放置30min~1h。血液凝固后，用细竹 棒或玻璃棒轻轻剥去试管壁上的血饼， 再在2500~3000 r/min离心5~10min，上 层淡黄色液体即为血清（serum）
• 血清比血浆只是少一种纤维蛋白原 C血浆= C血清 血浆比血清的分离快，而且制取量约为 全血的50%~60%（血清为全血的 20%~40%），多数用血浆进行分析。 若血浆中含有的抗凝剂对药物浓度测定 有影响时，则应使用血清样品
据和相关信息, 有助于药物生产、研究、临床
应用等方面对药物作出估计与评价。
• 如果没有体内药物分析提供的数据和相关信息，
进行临床药学研究是不可想象的。
• 体内药物分析是一门研究生物机体中药物及其 代谢物和内源性物质的在体内质与量变化规律 的分析方法学
• 意义：
（一）新药评价和开发中的意义 （二）临床合理用药中的意义 （三）药物作用机制探讨 全性、有效性 （四）代谢分型研究中应用 药物质量评价的安
• 唾液样品采集后，应立即测量其除去泡 沫部分的体积，以3000rpm离心10min， 取上清液直接测定或冷冻保存
生物样品的贮存与处理 • 冷藏—冰箱(4℃)中短期保存(1~2d) • 冷冻—冷柜(-20℃)或低温冷柜(-80℃) 中长期保存 注：冷藏或冷冻时限经稳定性考察后确定
• 血样 ： 采集后及时分离血浆和血清（≤2h），分离后再 贮存 —若不予先分离，血凝后冰冻保存，则因 冰冻有时易引起细胞溶解，会阻碍血浆或血清的 分离 —置硬质玻璃试管中完全密塞后保存 • 尿样 采集后应立即测定，若不能立即测定，加入防腐 剂后保存 常用防腐剂：甲苯、二甲苯、氯仿、醋酸、浓盐 酸等 甲苯在尿液表面形成薄膜 醋酸改变尿液酸碱性抑制细菌的生长 保存时间为24~36h(4℃)或长期(-20℃)
பைடு நூலகம் （二）去除蛋白质
• 非破坏性生物样品预处理的第一步 可使结合型药物释放 1.去除蛋白后取上清液直接分析测定 2.去除蛋白后取上清液经进一步分离 纯化、浓集后分析测定
• 去除蛋白质的方法 1. 加入与水混溶的有机溶剂—蛋白质脱水沉淀 2. 加入中性盐—“盐析”沉淀蛋白质 3. 加入强酸—与蛋白质阳离子(铵基) 形成不溶性盐 沉淀 4. 加入重金属盐—与蛋白质阴离子 (羧基)形成不溶 性盐沉淀 5. 超滤法—半透膜滤除可溶性生物大分子物质(蛋 白质) 6. 酶水解法—蛋白分解酶分解蛋白质 7. 加热法—蛋白质变性凝固
• 2、干法破坏 • 高温炉高温破坏 • 应用——适合人发样品的破坏
• 3. 氧瓶燃烧（oxygen flask combustion） 特点——操作简单、快速、设备简单 应用——血浆、人发中卤素、硫、硒等 • 血浆：血浆1ml分次点于无灰滤纸上 →60℃烘干→按规定折叠后固定 • 人发：洗净、干燥（60℃ ~ 80℃）→ 剪碎→ 称取0.1 ~ 0.3g置无灰滤纸中心→按规定折叠 固定
4. 加入含锌盐及铜盐的沉淀剂 当溶液pH高于蛋白质的等电点时，蛋白质分子中带阴电 荷的羧基与金属阳离子形成不溶性盐沉淀 常用沉淀剂—CuSO4-Na2WO4、ZnSO4-NaOH 血清与沉淀剂比例—1∶(1~3)， 分离—高速(10000r/min)离心 ，上清液pH分别为5.7~7.3 和6.5~7.5
3.药物测定目的
• 药物测定目的不同——样品预处理的要求不同： • 急性中毒病例——要求快速鉴定所怀疑的药物， 应在尽可能短的时间内获得其浓度的数据，对样 品预处理的要求可以粗放些 • 测定药物及代谢物——要求使代谢物从缀合物中 释放出来并在不同pH介质中分离获得酸性、中 性或碱性代谢物，对样品预处理的要求全面、细 致
• 1. 湿法破坏 • 常用试剂—硝酸或硝酸-高氯酸 • 特点—破坏能力强、反应激烈，无机 金属离子为高价态 • 应用—适用于血、尿、组织等生物样 品的破坏 • 缺点—含氮杂环药物的破坏不够完全 • 注意—切勿蒸干、以免爆炸 • 样品用量—金属元素量10~100g，血样 10~15ml、尿样50ml
• 5. 样品预处理与分析技术的关系 • 1.分析方法特点(是否专属、是否具有分离能 力) • 2.检测系统对杂质污染的耐受程度 决定样 品预处理和需要净化的程度
三、生物样品的预处理与制备技术
• （一）有机破坏法 应用——微量元素测定 方 法 • 1．湿法破坏 • 2．干法破坏 • 3．氧瓶燃烧法
• 1. 血样的采集 一般用注射器直接采集静脉血，每次 1~5ml；动物实验时，采血量不宜超过动 物总血量的十分之一
注：测定血中药物的浓度，通常是指测定 血浆或血清中的药物浓度，尤其是血浆， 并非指全血
• 血浆的制备 采集的静脉血液置含有抗凝剂的试管中， 混合后，以2500~3000r/min离心5~10min 使与血球分离，所得淡黄色上清液即为 血浆（ plasma ）
3. 加入强酸
常用的强酸——10%三氯醋酸、6%高氯酸、5%偏磷酸等 试剂用量——血清与强酸比例为1∶0.6时，除去90%以上的蛋白质 分离——高速(12000r/min)离心1~2min ，上清液pH 0~4 过量三氯醋酸——煮沸分解为氯仿和二氧化碳 高氯酸——碳酸钾、醋酸钾或氢氧化钠等中和后加乙醇使产生高 氯酸钾（钠）沉淀
• 全血的制备 成 分： 血浆 有形物质：红细胞 白细胞 血小板 • 全血的制备 • 将采集的血液置含有抗凝剂的试管中，但不 经离心操作，保持血浆和血细胞均相状态， 即为“全血” （whole blood）
某些情况血浆内药物浓度波动大，或血浆浓度低，可用全血 （全血净化较血浆和血清麻烦） 血浆和红细胞中分配比不是 常数，则应使用全血样品
第二节 生物样品的种类、采集和制备
• 生物样品种类 • 脏器组织： • 体液 ： 血液、尿液、唾液、 毛发、乳汁、 精液、脑脊液、泪液、胆 汁、胃液、胰液、淋巴液、粪便等
• 最常用的生物样本 尿液—用于药物剂量回收、尿清除率、生物利用 度、内源性活性物质、药物代谢分型及代谢物等 的研究测定 唾液—用于某些S/P较为恒定的药物 的测定 毛发—可用于药物滥用监测及微量元素测定 肝、胃、肾、肺、脑等脏器组织 —动物试验研究 药物吸收、分布状态及服药过量中毒死亡
1.药物的理化性质和存在形式酸碱性
• (pKa)、溶解性——提取性质 • 挥发性——挥发损失及气相色谱法的应用 光谱特性——分析仪器的选择 • 官能团性质——化学衍生化和检测器应用 • 化学稳定性——处理条件的选择 • 存在形式及血浆蛋白结合率——预处理方法
2.待测药物的浓度范围
• 不同药物在体内中浓度相差极为悬殊 • ——地高辛治疗血浓为1~2ng/ml • ——水杨酸盐治疗血浓为20~100g/ml • 浓度大——预处理要求稍低 • 浓度低——样品制备要求高
一、生物样品预处理的目的
• 使药物从缀合物及结合物中释放 ——定药物的总浓度 • 使样品纯化——消除生物基质中内源性 物质的干扰 • 提高检测灵敏度——适应和符合测定方 法要求的灵敏度 • 防止分析仪器的污染和劣化——提高 分析仪器的耐受程度、改善分析结果
二、方法的选择
• 待测生物样品的类型决定样品预处理方法： 血浆、血清——常需去除蛋白质 唾液——主要采用离心沉淀除去粘蛋白 尿液——常采用酸或酶法使缀合物水解 头发——需要将头发进行有机破坏后 测定微量元素
血样主要应用于： 药物动力学 生物利用度 临床治疗药物浓度监测
• （二）尿液(urine) 尿液用于：药物剂量回收、药物尿清除率、生物 利用度的研究，预测药物代谢过程、类型 体 内药物清除主要是通过尿液排出，药物以原型、 Ⅰ相及Ⅱ相代谢物等多种形式排出 性状—淡黄色或黄褐色， 相对密度1.105~1.020，pH4.8~8.0 • 成分—水、含氮化合物、盐类等 • 微生物—防腐剂
• 唾液 • 为阻止酶催化生成粘蛋白，应在 4℃以下保存 —保存过程中放出二氧化碳而使pH升高，测定 唾液pH时应在取样的当时为好 —冷冻保存唾液时，解冻后有必要将容器内唾液 充分搅匀后再用，否则测定结果会产生误差
第三节 生物样品的预处理与制备
• 样品预处理技术 • 分离、纯化、富集或化学衍生化等，为药物 的最终测定创造良好的条件 • 样品的预处理是体内药物分析中极为重要的 环节；也是分析中最困难、最繁杂的工作 • ——对于生物样品的预处理很难规定固定的 程序和方式，必须结合测定实际和要求，采 取恰当的方法和技术
1. 加入与水相混溶的有机溶剂 • 常用有机溶剂:乙腈、甲醇、丙酮、四氢呋喃 血样与溶剂体积比—1∶(1~3)可除去90%以上蛋白 • 乙腈—块状絮凝物、易于分离；成分损失 可能性大， 上清液pH为8.5~9.5 • 甲醇—细小颗粒沉淀、不易分离；成分损失可能性小， 上清液pH为8.5~9.5 • 超速离心分离（12000r/min)—离心1~2min 2. 加入中性盐 • 常用中性盐—饱和硫酸铵、硫酸钠、镁盐、磷酸盐及枸 橼酸盐等 • 试剂用量—血清与饱和硫酸铵比例为1∶2时除去90% 以上的蛋白质分离—高速(12000r/min)离心上清液 pH7.0~7.7
• 尿液的采集 样本来源—自然排尿，成人一日排尿量 为1~5L（随时尿、晨尿、白天尿、 夜间尿及时间尿） 样本采集—一般采集时间尿（规定时间 内采集尿液体积和排 入尿中的药物总量
• （三）唾液 （saliva） 唾液—无损伤取样，易收集；一些药物的 唾液药浓(S)与血浆游离药浓(P)密切相关， 因此： —TDM中利用对S的测定代替对 P的监测 —药代动力学的研究 唾液采集 在潄口后15min，安静状态下采集口腔 内自然流出的唾液；也可在刺激下快速 采样(需注意干扰)
第十七章
体内药物分析 简介
第一节 概述 一、体内药物分析的性质
• 体内药物分析（生物药物分析）是药物 分析的重要分枝，是随着临床药学、临 床药理学的发展和需要而建立起来的综 合性的应用学科。 • 体内药物分析——研究药物在体内的 “命运”
• 通过分析手段了解药物在体内数量与质量的变 化，获得药物动力学参数和代谢的方式、排泄 的途径等信息，为临床药学研究提供必要的数