活性氧测定各种方法及原理

评述与进展 活性氧测定的基本原理与方法
林金明3
　屈　锋　单孝全
(中国科学院生态环境研究中心,北京100085)摘　要　综述了过氧化氢(H 2O 2)、一重态氧(1O 2)、超氧阴离子自由基(・O -2)以及羟自由基(・OH )等活性氧的测
定方法。

侧重介绍活性氧的化学反应法、捕捉法和直接测定法的基本原理和最新的进展情况,并比较了这几种方法的各自特点。

关键词　活性氧,化学发光,自由基,评述
　2001211208收稿;2002205205接受
本文系中国科学院“百人计划”和国家杰出青年科学基金资助项目(N o.20125514)
1　活性氧
氧是生命运动过程中不可缺少的一种气体,人们一旦处于缺氧或者供氧不足的环境中,就会感到憋气的痛苦甚至死亡。

所以,自从1770年代初英国人Joseph Priestley 发现氧以来,氧一直被人们认为是一种对人体百益而无一害的气体。

可是,科学技术迅速发展起来的今天,我们知道,不管是空气中的氧还是水中的溶解氧都具有较高的氧化性,与一般的金属铁一样,处于空气中的人体各部位都在不断地受到氧的腐蚀而“生锈”,当然这种腐蚀与铁不同,它体现在人体的细胞水平上。

特别是人体各种器官随着
年龄的增大不断地老化更是这种腐蚀“生锈”的直观表现。

1969年McC ord 与Fridovich 1发现,在生化反
应过程中O 2获得一个电子还原生成超氧自由基(O -2),进而经过红血球的分离精制后获得O -2的清除
灭活酶,并命名为超氧化物歧化酶(superoxide dismultase ,S OD )。

这一发现激发了大批的科学研究者致力于O -2的生成过程、反应活性、毒性、生理和病理等等各方面的研究,去探索解明S OD 在生理学上的意义。

同时由O -2衍生出来的过氧化氢(H 2O 2)、羟自由基(・OH )、
激发态氧(一重态氧或称单线态氧,1
O 2)也受到了人们的重视。

近10多年来,活性氧在人体内的作用受到人们极大的关注,报道了大量有关活性氧,特别是超氧自由基和羟自由基与机体细胞的许多功能活动以及各种疾病,如癌、动脉硬化、糖尿病、心脑血栓、缺氧再灌注综合症、感染以及衰老效应等相关的研究论文和著作2～8,引起人们对活性氧的普遍兴趣,从而激发了人们更深入地去研究活性氧的各种特性,开发各种相关的抗氧化、抗衰老物质,在医学和分子生物学领域已成为一项广泛引起重视的研究课题。

所谓的活性氧,概括地说,是指机体内或者自然环境中由氧组成,含氧并且性质活泼的物质的总称:
主要有一种激发态的氧分子,即一重态氧分子或称单线态氧分子(1O 2);3种含氧的自由基,即超氧阴离
子自由基(O -2)、羟自由基(・OH )和氢过氧自由基(H O 2);2种过氧化物,即过氧化氢(H 2O 2)和过氧化脂质
(ROOH )以及一种含氮的氧化物(NO )等。

这些物质化学反应活性强、存在寿命短,如1O 2的平均寿命为2μs 、・OH 自由基200μs 、O -2自由基5s 。

正是由于它们寿命短、反应活性高,到目前为止除了H 2O 2以外,其它活性氧的测定仍然是一项国际性难题,还没有特别专一有效的方法。

一般情况下采用的分析方法
可大体有化学反应法9～36、捕捉法37～47和直接测定法48～59。

本文按这样的3种分类针对不同活性氧的
测定方法作一概括性的总结,比较它们各自特点。

2　化学反应法
由于活性氧具有较高的反应活性,它们可以与许多不同的化合物发生化学反应,由此产生各种不同的反应生成物,根据这些反应生成物或者反应物的变化程度可以进行定量或者定性分析。

通常采用的
仪器分析方法有,化学发光法9～16、紫外2可见吸收分光光度法1,17～22、荧光光度法23～25、电子自旋探
第30卷
2002年12月 分析化学(FE NXI H UAX UE )　评述与进展Chinese Journal of Analytical Chemistry 第12期1507～1514
针26～29以及选择性电极法30～36等。

化学反应法的特点是测定灵敏度高、廉价、操作简便等。

但是,化学
反应法的特异性相对比较差,一些氧化还原反应或者酶催化反应往往对测定结果的判断产生影响,一般需要其他分析方法作为比较,才能获得满意的结论。

2.1　化学发光法
化学发光测定法是仪器分析中灵敏度最高的方法之一,已在医学、环境以及工业分析等许多领域里得到广泛的应用60～63。

活性氧的化学发光研究也是活性氧测定法研究领域中比较活跃的分支之一,特别是针对H
2
O2测定,有许多灵敏度高、选择性好的化学发光体系64～68。

进年来,笔者在H2O2测定方面开发了一系列高灵敏度的化学发光分析法69～72。

除此之外,目前比较成功的活性氧化学发光测定法主要有鲁米诺法(luminol)、光泽精法(lucigenin)和cypridina luciferin analog(C LA)法。

通常,鲁米诺在碱性溶液(pH10左右)中,首先形成单价阴离子,然后在催化剂,如酶,Fe2+、C o2+、Ni2+和Cu2+等过渡金属离子或者金属络合物的催化下与溶液中的溶解氧或者过氧化氢发生氧化还原反应,生成激发态的两价阴离子氨基肽酸盐(APD),APD经非辐射性跃迁回到基态时,放出光子73,74。

自从1928年Albrecht75报道了鲁米诺的化学发光现象以来,70多年过去的今天,鲁米诺的化学发光反应机理仍然没有得到满意的解决。

近年来,笔者在研究金属过氧化物的化学发光时发现,在不存在任何
催化剂的条件下,向BaO
2或者MgO2固体粉末中注入鲁米诺溶液,仍然可以观察到很强的发光现象
76,这一发现已被应用于以鲁米诺衍生物ABEI作为标记物的化学发光柱后测定法77,78。

利用固2液非均相化学发光体系,在弱酸性或者非缓冲介质条件下,同样能够观察到鲁米诺与过氧化氢的发光现象71。

这些结果表明,鲁米诺发光与否取决于活性氧的生成条件,而与鲁米诺溶液的酸碱度似乎没有直接的关系,介质的酸碱度影响了激发态APD的发光强度和发光波长。

所以,从理论上来说,鲁米诺化学发光法
可以应用于各种不同介质中的H
2
O2、・O-2、・OH、1O2测定,这就导致了测定选择性差的问题。

因此,在许多情况下,活性氧的鲁米诺化学发光法只能作为定量或者定性分析的辅助手段。

在发现鲁米诺化学发光后不久,G leu和Petsch两人79于1935年发表了第一篇光泽精化学发光的论
文。

在碱性条件下,光泽精与H
2
O2,O-2等过氧化物作用形成激发态N2甲基吖啶(N2methylacridan)。

相比之下,光泽精对于活性氧测定的选择性则相对比较高,有许多报道76,80,81光泽精只有在超氧活性自由基
存在下发生发光现象。

但是,在实际应用中,H
2
O2的分解过程同样产生O-2自由基,难以定性地判断分析结果。

还有一类特殊的化学发光试剂,化学名称为22methyl262phenyl23,72dihydroimidazo21,22a pyrazin232 one,简称C LA,1970年代由日本化学家G oto等82合成。

C LA的特点是不与生物机体内的H2O2或者・OH发生反应,只与O-2或者1O2发生特异性的化学发光反应,发光波长为380nm83。

这一现象已被应用于白血球的功能性检查方面的研究84～86。

G oto等87还开发了C LA的衍生物,MC LA、FC LA、Nakano和Fujim ori等88～90对这一类试剂的化学发光机理和反应的动力学作了详细的研究,报道了C LA,MC LA与活性氧的化学反应机理。

FC LA是目前化学发光试剂中发光波长(532nm)最长的试剂,发光效率比C LA 高出近10倍,由于这一特点,在进行生物样品中・O-2或者1O2测定时,能够有效地降低酶、・OH等干扰物质的影响。

2.2　分光光度法
活性氧的分光光度测定,最常用的方法有细胞色素丙(cytochrome C)的超氧自由基还原法1,20和硝基四氮唑篮(nitro blue tetrazolium,NBT)还原法92。

具有氧化活性的细胞色素C被・O-2还原后,形成了在波长550nm处有强吸收的亚铁细胞色素93,可以用于O-2的直接测定,在S OD存在下,O-2受到S OD的
催化形成H
2
O2和O2,以被开发为S OD的间接定量分析法94。

但是,活性氧的细胞色素丙还原法存在着其它还原性物质,如H ADPA和还原性酶的干扰,一般情
况下无法直接用于O-
2的定性分析,需要比较在S OD的存在下,是否还有O -
2与细胞色素丙发生反应的结果,从而判断O-
2的生成与否。

同样,如图1所示,NBT在O-
2的作用下,还原生成不溶于水、蓝色的二甲替(diformazan)92,95,它的
8051 分析化学第30卷
图1　硝基四氮唑蓝与超氧阴离子自由基反应的颜色变化
Fig.1　C olor change of the reaction of nitro blue tetrazolium
with superoxide anionic radical ion 最大吸收波长560nm ,吸光系数达10,000以上,测定
灵敏度相当高。

笔者在进行KI O 42H 2O 2化学发光反
应体系的机理过程中70,使用NBT 反应测定O -
2,获得良好的结果。

但是,由于二甲替不溶于水,长时间
放置会出现沉淀现象,难以应用于测定细胞或者水
溶液体系中O -2形成的时间推移变化。

Sutherland 和
Learm onth 96报道了利用水溶性NBT 衍生物测定O -
2的方法,解决了生成物沉淀所导致的测定困难问题。

应用分光光度法测定活性氧的比较简单方法还
有H 2O 2的T i ∆检测法97,辣根过氧酶(HRP )法20,
过氧化物酶法21和乙醇脱氢催化酶法98
等等。

2.3　荧光光度法
与化学发光一样,荧光分光光光度法也是灵敏
度高,操作简便的分析方法之一。

利用荧光光度法
测定活性氧的报道不多,这里仅举几个例子,希望能
够起到抛砖引玉的作用。

比较典型的例子是,二氯
荧光素(DCFH )在过氧化物酶存在下,被H 2O 2或者
H O -2氧化形成具有有萤光的DCF ,可以有效地应用于H 2O 2定量分析
23。

利用2,32二氨基萘(DAN )与NO -2在酸性条件下发生反应,形成荧光性的12(H )2萘三氮茂环,有人提出用2,32二氨基萘(DAN )作为NO 的测定方法24。

最近,K ojima 等25开发了可以应
用于生物机体或者细胞培养过程中NO 测定用的二氨基荧光素222联乙酰(DAF 222DA ),检测灵敏度达5nm ol ΠL NO 。

随着合成技术的不断提高,相信今后还会出现更灵敏、使用更为方便的活性氧测定用的荧光试剂。

2.4　电子自旋共振法(ESR 法)
ESR 作为活性氧的化学反应后的检测方法,可以理解成是一种自由基的标识反应,即向活性氧生成的反应体系中添加本身带有不对称电子的自由基,这一添加物与活性氧发生反应后失去不对称电子,从
而导致ESR 信号的变化。

Utsumi 等27在研究生物机体或者生物膜的构造过程中,使用了硝基木酮自由
基作为反应的添加物,硝基木酮自由基在与O -2,OH 或者生物微粒体(micros ome )等的电子传输系统发
生反应过程中,被还原生成羟胺或者羟氨基,从而失去单自旋电子,在ESR 测定中体现为信号的减弱。

另外,与T MP (2,2,6,62tetramethyl 242piperidone )类似的哌啶衍生物,在1O 2的作用下,可与硝基木酮自由基
发生氧化还原反应,也可应用于1O 2的测定26。

但是,这一方法同样存在测定选择性差的问题,除了1O 2以外,其他种类的活性氧或者电子供给体同样可以向硝基木酮自由基提供电子,影响对ESR 信号的判
断,需要得到进一步改进和完善。

有关这一方面的详细综述可以进一步参考文献29,99。

2.5　电极测定法
利用选择性电极法测定活性氧的报道相对比较多,比较成功的例子是利用过渡金属镍2扑啉的高分
子膜微电极测定单一细胞中的NO 30,NO 的检测限达10-20m ol ,并且选择性也相当不错。

还有一类比较
成功的研究是H 2O 2电极法测定,Lv ovich 与Scheeline 33报道了一种可以同时应用于O -2和H 2O 2测定的
复合电极,他们采用电沉积的方法,把聚吡咯(polypyrrole )ΠHRP 覆盖在玻碳电极表面,作为H 2O 2的传感器;另一玻碳电极在以上处理的基础上,再覆盖上一层聚吡咯ΠS OD 膜,用于O -
2的测定,这种复合电极的可使用酸度范围在pH 5.1～9.0,非常适合于生物样品的分析。

从现有的报道来看,活性氧电极大多是建立在酶催化的基础上,在测定过程中,往往出现酶不断脱离作为其支持体的高分子膜,容易导致电9051第12期林金明等:活性氧测定的基本原理与方法
极寿命缩短和测定结果不稳定的问题。

所以,从某种程度上来说,寻找和建立有效的酶固定方法是电极法今后发展的方向之一。

3　活性氧的捕获法
捕获法就是利用某些捕捉剂或者捕获剂,把反应活性强、寿命短的活性氧捕获之后加以测定。

但是,在许多情况下,活性氧捕获反应所产生的反应生成物一般不只一种甚至两种以上,需要经过分离测定。

目前最常用的分离分析法有高效液相色谱法(HP LC )和气相色谱法(G C )。

针对一些不稳定的自由基,还有一种方法是可以利用自旋电子捕获法(spin trap ),即向自由基生成的反应体系中,添加一种不对称电子的捕获剂,如最常用的有,5,52二甲基吡咯啉212氧化物(5,52dimethyl pyrroline 212oxide ,DMPO ),在与自由基作用后形成较为稳定的自由基附加生成物,利用ESR 仪进行测定。

3.1　色谱法
Smith 等100,101研究结果表明,1O 2与胆固醇发生特异性反应,生成5α2过氧化胆固醇102,而胆固醇的
自动氧化反应或者自由基反应的生成物分别为7α2过氧化胆固醇和7β2过氧化胆固醇,经过HP LC 分离
后,可以确认不同的反应生成物39。

这两类不同的生成物同时也证明1O 2与胆固醇反应的特异性。

但
是由于1O 2与胆固醇反应速度慢,导致测定的灵敏度低,在实际应用过程中,往往采用碳14标记胆固醇来提高检测灵敏度。

这一方法已被应用于生物微粒体脂质的过氧化反应
103,含有增感剂的磷脂膜中产生的1O 2104的测定。

作为・OH 的捕获剂,水杨酸与・OH 反应生成2,32以及2,52二羟基安息香酸37,通过HP LC 分离后得
以定量分析,这一方法已成功地应用于白兔的贫血、再灌流阻害的研究,其结果表明这些症状与・OH 有
着密切的相关性41。

K amiya 等40报道了在生物机体内经过・OH 或者1O 2反应生产82羟基鸟嘌羚(82OH 2
G ua ),利用HP LC 分离分析发现人体的白血球以及尿液中含有82羟基鸟嘌羚的研究事实。

从这些例子来看,在各种标准试剂具备的研究条件下,利用各种分离分析法测定自由基反应生成物,可以有效地判断反应物活性氧的类型。

3.2　电子自旋共振法
如图2所示的自由基捕获法的基本原理,DMPO 、P BM (α2pheny 2N 2tert 2butynitrone )等自旋电子捕获剂,
与自由基发生反应后形成相对稳定的自由基附加生成物,然后用ESR 法进行测定
43。

DMPO 具有良好　图2　自旋电子捕获法的基本原理和3种重要捕获剂
Fig.2　
Basic principle of spin trapping method and three important spin traps DMPO :5,52四甲基吡咯啉212氧化物(5,52dimethyl 212pyrroliue 212oxide ;T MPO :3,3,
5,52四甲基吡咯啉212氧化物(3,3,5,52tetramethyl 212pyrroliue 212oxide );DBNBS :3,
52二溴242亚硝基苯磺酸盐(3,52dibrom o 242nitros obenzene sulfonate )。

的水溶性,有利于实验的操作和溶液
配制,更重要的一点是DMPO 或者P BN
与O -2,・OH 反应后,所测定到的ESR 谱
图有明显的差别,能够快速地区别出
O -2和・OH 。

ESR 谱的峰数目及其超精
细结合常数(h fs :hyperfine splitting ,信号
峰之间的距离)是自由基与DMPO 、P BN
形成自由基附加生成物的特有特征,与
ESR 的g 值具有同样重要的意义,可以
应用于O -2或者・OH 的定性分析。

但
是,这个方法也存在着它的不足之处,
与O -2形成的自由基附加生成物DMPO 2OOH 在生理条件下,会逐渐地转变为与・OH 的自由基附加生成物DMPO 2OH 类似的ESR 信号,使得O -2,・OH 的判断成为困难,K ohno 等45采用向测定体系
中添加二甲亚枫(DMS O )的方法良好地解决了这一问题。

最近,R ouband 等46报道一种新的DMPO 的衍0151 分析化学第30卷
生物,DEPM O 52(dithoxyphosphoryl )252methyl 2pyrroline 2oxide ,这一试剂可与O -2形成稳定的自由基附加生
成物(半衰期约15min ),这种生成物具有特征性的12个峰的ESR 信号,使用方便,易于定性判断。

到目前为止,利用自由基捕获法的ESR 测定仍然是氧活性自由基测定的主要手段之一,开发象这样的一类反应特异性高、稳定性好的自旋电子捕获剂将继续是活性自由分析重要的研究方向之一。

4　直接测定法
能够用于活性氧直接测定的方法目前还相当少,已报道的只有1O 2发光测定法和具有不对称电子自由基的ESR 法。

下面就这两种方法作简要的介绍。

4.1　1O 2的发光测定法
实际上,1O 2有两种不同的存在状态,16+g 和1Δg ,在水溶液中,1Δg 的存在寿命为4.2μs 105,而16+g 图3　一重氧的分子状态及其共存的迁移分子对状态
Fig.3　Oxygen singlet m olecule state and simultaneous
transition m olecular 2pair states 存在的寿命更短,一般要求1O 2浓度在10
-3m ol ΠL 以上106,存在寿命不到10-10s ,如此短暂的存在时间,
导致了测定上困难,所以,水溶液中参与化学反应的
往往是1Δg 状态的1O 2。

从氧的分子轨道的电子排布
可以看出,1Δg 具有亲电子的反应特性,而1Δ+g 的激
发态能量高于1Δg 状态的1O 2,电子由激发态跃迁回基
态时以发光的形式释放出能量,部分已知的发光波
长如图3所示。

在这些波长中,还无法肯定634nm
和762nm 是来自于1O 2放射的能量50,但是1268nm
的发光属于1O 2发光的特异性波长已被公认
51,通过测定这一波长的发光来确定1
O 2的方法已被广泛地得到应用53,54,56,57。

4.2　电子自旋共振法反应活性高、寿命短的O -2,・OH 自由基的直接测
　图4　超氧自由基的电子自旋共振谱图Fig.4　E lectron spin res onance (ESR )spectra of
superoxide radicals 11由黄嘌呤与黄嘌呤氧化酶在77K 条件下反应产生的超氧自由基离子(the superxide radical ion generated from the reaction of xanthine with xanthine oxidase at 77K );21由过氧化氢与高碘酸钠在77K 下反应生成的超氧自由基离子(the superoxide radical ion generated
from the reaction of H 2O 2with NaIO 4at 77K )。

定法,目前只有ESR 法。

但是这一方法在室温条件下无法
进行,必须结合超低温冷冻和快速混合法,以提高可被测定
的自由基浓度。

ESR 法灵敏度高,定性分析的可信度好的
同时,也存在着仪器昂贵,操作程序相对复杂,并且要求液
态氮或者其他低温液化气作为冷冻剂等问题。

能够同时具
备ESR 仪器和超低温(77K 甚至更低)液化气发生装置的
研究单位还不多。

目前研究自由基的方法还是以化学分析
法为主,以直接测定法为对照。

图4所示O -2的是两种典
型的ESR 直接测定谱图58,冷冻状态下的O -
2自由基在外部磁场作用下,可以通过ESR 谱图测定计算出不对称电子的旋转方向受到磁场的影响而发生变化,与磁场方向相平行的g ∥和相垂直的g ⊥。

每一种自由基都有它特有的g 值,是确认自由基的重要测定数据。

尽管ESR 直接测定法被
认为是目前自由基分析选择性最好的手段,但是如图4所
示一样,自由基测定的ESR 信号同样也受到共存离子、溶
剂等条件的影响,同一种自由基在不同测定环境中,所得到
的ESR 谱图往往有一定的差别,给结果的分析带来困难。

1151第12期林金明等:活性氧测定的基本原理与方法
2151 分析化学第30卷
5　结 语
从以上的各种方法的比较来看,能够进行直接测定的活性氧的种类不多,直接测定的方法也相当有限,而到目前为止化学反应法和捕获法的分析选择性和可信度还难以令人满意。

而在医学、环境等许多领域里,迫切需要开发高灵敏度、高选择性的活性氧以及其他一些活性自由基的测定方法。

特别是活性氧的in viv o测定,对于解释生命机体的各种生理、病状等有着重要的意义,建立简便可靠的活性氧以及其他自由基的测定方法,对于获取人体内的各种变化的情报将与DNA的解释具有同等重要的意义,有关in viv o测定方法可以进一步参考文献8和99。

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Determinations of Active Oxygen Species and
Their B asic Principles
Lin Jinming3,Qu Feng,Shan X iaoquan
(Research Center for Eco2Environmental Sciences,Chinese Academy o f Sciences,Beijing100085)
Abstract　The detection methods of s ome im portant active oxygen species,e.g.,hydrogen peroxide,singlet oxygen,superoxide anionic free radical and hydroxyl free radical are reviewed with106references.
K eyw ords　Active oxygen species,chemiluminescence,free radical,review
(Received8N ovember2001;accepted5M ay2002)。