基因治疗

基因治疗
回答如下几个问题:
什么叫基因治疗？
What is gene therapy?
基因是如何传递的？
How are genes delivered?
哪些疾病可用基因治疗？
Which diseases can be treated?
临床试验的最新情况？
What is the status of current clinical trails?
基因治疗的前景如何？
What are the future prospects?
第一节概述
1.基因治疗的概念
一般是指将限定的遗传物质转入患者特定的靶细胞，以最终达到预防或改变特殊疾病状态为目的的治疗方法。

基因治疗（Gene therapy ）：指应用DNA重组技术，将外源正常基因导入靶细胞，以纠正或补偿因基因缺陷和异常引起的疾病,以达到治疗的目的。

2.基因治疗的主要策略
基因置换（gene replacement)或称基因矫正（gene correction）：特定的目的基因导入特定的细胞，通过定位重组，让导入的正常基因置换基因组内原有的缺陷基因，不涉及基因组的任何改变。

基因添加或称基因增补（gene angmentation）：通过导入外源基因使靶细胞表达其本身不表达的基因。

基因干预（gene interference）：采用特定的方式抑制某个基因的表达，或者通过破坏某个基因而使之不能表达，以达到治疗疾病的目的。

基因置换或基因添加的必要条件
对导入的基因及其产物有详尽的了解
外来基因能有效地导入靶细胞
导入基因能在靶细胞中长期稳定驻留
导入基因能有适度水平的表达
基因导入的方法及所用载体对宿主细胞安全无害
导入自杀基因－－细胞自杀效应
将自杀基因转移入宿主细胞中，该基因编码的酶能使无毒性的药物前体转化为细胞毒性代谢物，诱导靶细胞“自杀”，清除肿瘤细胞。

基因修饰－－改变细胞功能
基因修饰肿瘤细胞的“疫苗”疗法
基因修饰TIL的过继免疫方法
免疫增强基因疗法
原位修饰肿瘤免疫原性的基因疗法
基因标记（gene labeling）：基因标记实验是基因治疗的前奏，并不在于直接治疗疾病而是期望能够提供有关正常细胞生物学和疾病病理方面的信息。

3.基因治疗步骤
基因导入（administration）：把基因或把含有基因的载体导入机体。

基因传递（delivery）：基因从导入部位进入靶细胞核。

基因表达（expression）：细胞中治疗性基因产物的形成。

第二节基因转移技术和靶细胞
1.基因治疗方式
基因治疗的基本方式：
体内直接转基因
体内法in vivo
体细胞介导的基因治疗
回体法ex vivo
基因转移的方法：
生物学方法
逆转录病毒载体，腺病毒载体，腺病毒相关病毒载体，单纯疱疹病毒载体
非生物学方法
脂质体，直接注射，受体介导基因转移技术，其它方法
基因治疗载体
载体是治疗性遗传物质的携带者或运输工具。

载体的类型：病毒载体，非病毒载体
理想的基因治疗载体具备的性质
易于进入靶细胞。

在特异细胞或组织达到有规律、充分及持续的外源基因表达。

外源基因应含或整合于基因组活化区内或能自主复制的构件。

整个过程应安全有效并具有选择性。

易于大量生产。

基因治疗载体的选择（考虑因素）
靶细胞或靶组织
疾病类型
期望是否持续或短暂表达
所要求的基因表达水平
体内或回体基因治疗
安全性：风险效应比。

基因转移的生物学方法
病毒载体类型
重组型病毒载体:以完整的病毒基因组为改造对象，选择性删除病毒的某些必需基因（早期基因、控制表达的基因），缺失的功能由互补细胞反式提供；利用同源重组方法将适当长度的外源基因插入病毒基因组的非必需区,不改变病毒复制和包装所需的顺式元件。

无病毒基因的病毒载体：由载体质粒和辅助系统组成。

载体质粒：由外源基因表达盒、病毒复制和包装所必需的顺式作用元件及质粒骨架组成；辅助系统：由病毒复制和包装所必需的反式作用元件组成
逆转录病毒载体
优点：高效地感染分裂的宿主细胞（100%）；在感染后，逆转录病毒能够将前病毒基因组稳定地整合到宿主基因组的随机位点上；利用重组逆转录病毒能将目的DNA传递给整个细胞群体；逆转录病毒载体可感染多种人和动物的细胞，宿主范围非常广；不产生任何有免疫原性的病毒蛋白，对宿主细胞无毒性作用，可建立细胞系长期持续表达外源基因。

缺点：只能整合至分裂相的细胞；容量小（不超10kb)；病毒滴度不高；由于其随机整合，有激活癌基因的潜在危险。

逆转录病毒的生活周期
进入宿主细胞双链RNA
逆转录酶
双链DNA前病毒
整合到宿主细胞基因组DNA中
宿主细胞RNA聚合酶II
mRNA
病毒RNA基因组作为合成相应
病毒蛋白质的模板
包装成新的病毒颗粒，离开宿主
腺病毒载体
优点：转染效率高、安全；宿主范围广，与细胞分裂无关；容量大，制备较易，病毒滴度较高。

缺点:不能整合到染色体,表达时间短暂(1-6周);具有免疫原性;反复治疗效率降低;缺陷病毒可与宿主基因组或其它病毒发生重组,产生危险系数高的新病毒
腺相关病毒
优点:是非病原微生物,未发现野生型adeno -associated virus（AA V）与人类疾病有关;它既能感染分裂细胞,又能感染非分裂细胞;宿主范围广,能感染多种宿主细胞;插入突变的危险性相当低。

缺点：只能包装小于5kb的目的基因片段，相对转基因能力受限；整合时需要辅
助病毒感染才能进行复制，增加包装的难度；很难大量生产
单纯疱疹病毒载体
优点：HSV载体能携带30-50kb的外源基因，可在多种细胞中复制；能感染分裂和非分裂细胞，对神经细胞易感。

缺点：病毒不能整合入宿主细胞染色体，只能短暂表达；对感染的细胞产生毒性作用。

病毒载体(病毒传递系统)
病毒载体小结
尽管当前的临床试验中逆转录病毒载体仍然广泛应用，但腺病毒载体的应用日益增加。

腺病毒载体存在抗病毒免疫及毒性问题，其替代载体是腺相关病毒载体。

HSV载体容量大并具有嗜神经性，使之适合于神经性疾病的基因治疗，其转移效率高，但毒性仍成问题。

存在的共同问题：基因产物过度表达，引起免疫反应；可能产生有传染性或辅助型病毒；可能随机整合于宿主基因组中，从而激活或抑制癌基因；随机插入突变；携带外源基因的容量小；宿主范围有限；外源基因导入低。

今后任务：如何通过对各种不同的病毒载体系统优化获得简便、高效的包装系统、可调控表达外源基因的病毒载体、靶向性载体及无病毒基因的病毒载体。

基因转移的非生物学方法
基因治疗的非病毒载体
非病毒方法是依赖细胞机制将DNA导入细胞进而转移至细胞核。

与病毒载体相比非病毒载体的优点：对受转移的DNA大小没有限制；DNA 容易进行操作，对于包装与复制需要的病毒序列没有特殊要求；比构建的病毒载体安全，不可能诱发任何感染；免疫源性问题少。

㈠脂质体
㈡直接注射
㈢受体介导基因转移技术
㈣其它方法
理想的非病毒DNA传递系统应具备的性质：
已知结构及成分
在生物液体中，传递系统的稳定性受到复合物成分的控制
细胞摄取受细胞特异性浆膜受体的控制
能迅速从内容泡中释放（依赖于pH值）
能有效地脱包膜并经细胞质运输DNA
DNA的核摄取充分
能达到所期望的持续表达
脂质体( liposome )
脂质体是由脂类形成的一种可以高效包装DNA的人造单层膜，是一种脂质双层包围水溶液的脂质微球。

其结构和性质与细胞膜极为相似，二者易于融合，DNA由于细胞的内吞作用进入细胞。

脂质体与细胞相互作用产生胞内DNA传递的可能模式
直接注射
裸DNA通过物理或机械方法导入－－基因枪
方法：注射，包埋
溶液类型对基因表达有影响：
重组DNA可贮存于5%~30%的蔗糖溶液中
也可用生理盐水或PBS
其它方法
磷酸钙共沉淀法
电穿孔法
显微注射法
基因枪法
基因转移的靶细胞
靶细胞的选择须考虑：
最好为组织特异性细胞
细胞较易获得，且生命周期较长
离体细胞较易受外源基因转化
离体细胞经转染和一定时间培养后再植回体内，仍较易成活
转基因靶细胞的选择
选择目的基因表达的组织细胞最好是组织特异性细胞。

细胞较易获得，且生命周期较长。

离体细胞较易受外源遗传物质转化。

离体细胞经转染和一定时间培养后再植回体内仍较易成活。

目前常用的靶细胞有：
造血细胞
皮肤成纤维细胞
肝细胞
血管内皮细胞
淋巴细胞
肌肉细胞
肿瘤细胞
第三节反义RNA、核酶和三链DNA在基因治疗中的作用
反义RNA
反义RNA可作为一种调控特定基因表达的手段。

合成的RNA用于体内基因治疗，必须解决的关键问题：专一性转移问题；反义RNA进入靶细胞前的降解问题。

受体介导反义RNA转移技术可以满足反义RNA在基因治疗中的专一性高、抗降解作用强的要求。

受体介导的反义RNA基因治疗的优点：
安全性高；
反义RNA设计和制备方便；
具有剂量调节效应；
能直接作用于一些RNA病毒。

小干扰RNA（siRNA）
siRNA一般不会在哺乳类细胞中诱发蛋白质合成的非特异性抑制；
用人工合成的siRNA可特异地抑制哺乳类细胞中外源性或内源性基因的表达；
siRNA诱发的基因抑制具有高度的序列特异性。

siRNA的临床应用潜力
siRNA可用于肿瘤的基因治疗
siRNA可用于病毒性疾病的基因治疗
核酶（ribozyme）
RNA组成的酶
可催化RNA切割和RNA剪接反应。

结构：锤头状和发夹状。

具有催化RNA切割的核酶可作为基因表达和病毒复制的抑制剂，目前已被开发用于基因治疗。

核酶临床应用潜力
核酶作为抗病毒药物的潜力：下列病毒感染是核酶治疗潜在的靶子：HIV-1、乙型、丙型和丁型肝炎病毒、A型流感病毒、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒和牛白血病病毒。

核酶用于癌症治疗
三链DNA（triple-strand DNA）
当某一DNA或RNA寡核苷酸与DNA高嘌呤区结合时可形成三链。

三链形成寡核苷酸（triple-forming oligonucleotide，TFO）能特异地结合在DNA大沟中，并与富含嘌呤链上的碱基形成Hoogsteen氢键。

TFO与靶DNA的结合具有高度序列特异性，这是三链DNA的应用基础。

TFO的作用机制：基因调控区形成三链DNA后抑制基因转录
专一性地干扰DNA与反式作用因子的结合，抑制转录起始或转录延伸，达到反基因的目的。

技术关键：
TFO（ODN）的设计与合成
专一性
稳定性
摄取及分布
三链技术可用于下列疾病
病毒性感染：HIV-1、单纯疱疹和乙型肝炎。

癌症
基因治疗的受控表达
内容：时间、空间、水平三个层面
时间：控制治疗基因在患者需要实施治疗时才表达；根据不同疾病的治疗方式，控制治疗基因持续表达的时间跨度。

空间：严格限制治疗基因只在靶细胞中表达（专一性和安全性）
水平：治疗基因在一个适当的水平表达（避免毒副作用）
第四节基因治疗的应用研究
基因治疗在临床上的试验和应用
基因治疗方案用于人体之前必须进行三个阶段的试验，即体外研究，小鼠体内研究和灵长类动物体内研究，以保证对人体无害。

一、遗传病的基因治疗研究
1990.9.14 首例基因治疗
4岁女孩严重免疫缺陷症(SCID)
缺乏腺苷酸脱氨酶(ADA) 2--脱氧腺苷含量升高毒性严重破坏免疫功能
ADA基因LN逆转录病毒载体
靶细胞为病人淋巴细胞回输
二、肿瘤的基因治疗研究
㈠修正肿瘤相关基因的功能
恢复抑癌基因的功能
纠正癌基因的表达
㈡导入特定的基因产生肿瘤特异的药物敏感性
自杀基因疗法
HSV-tk
㈢肿瘤的免疫基因治疗
外源基因导入肿瘤细胞
细胞因子，MHC ⅠⅡ
外源基因导入免疫细胞
TNF
肿瘤的免疫基因治疗面临的问题
细胞因子作用的双重性
细胞因子基因转染肿瘤细胞疫苗的有效性
三、病毒性疾病的基因治疗
诱导对病毒RNA的降解：
抑制病毒与宿主细胞的结合：
干扰病毒基因组的转录起始和调控：
抑制病毒基因组的复制和蛋白质合成：
RNA干扰技术：
基因治疗的前景与问题
基因治疗中所用的各种启动子，在不同种类的体细胞中表达效率是不同的。

基因治疗研究中，体外基因转移是一个重要的研究领域，人体细胞在体外进行长期培养和繁殖，细胞的生物学改变是值得研究的问题。

要有效和简便地将基因治疗应用于临床，需要发展体内基因转移方法。

导入外源基因对机体的不利影响也是一个不容忽视的问题。