分子生物学课件第13讲

（三）基因间移框抑制突变 Nanjing 1，tRNA分子结构的改变导致的 University 移框突变抑制（图5-6） 2，tRNA分子与两个碱基配对引 起的移框突变抑制（图5-6） （四）温度敏感抑制突变和抑制增强 突变 1，温度敏感抑制突变 2，抑制增强突变
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•退火温度：
低
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2，第二轮 PCR •引物：长 侧翼引物 / 第一轮 PCR的产 物（大引 物） •退火温度： 高
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3，将PCR扩增产物 连接到载体分子上
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三、盒式诱变
•原理：当靶DNA序列两侧 存在两个限制性酶切位点 时，两者之间的DNA序列 就可以被酶切去除，并由 一段人工合成的具有突变 位点的寡核苷酸片段取代 野生型基因中的相应序列
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2，增变基因的分类
（1）DNA聚合酶的基因 （2）错配修复系统基因
•dam基因
•mut基因 六、紫外线的致突变作用
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七、突变 热点
（一）突 变热点 的检测
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（二）突变热点形成 的机制
1，5-甲基胞嘧（MeC） 啶造成的突变热点
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1，Kunkel定点诱变法
•脱氧尿苷三磷酸酶缺陷 （dut-）和尿嘧啶-N-糖 基酶缺陷（ung-）大肠 杆菌的特点：可以合成 掺U的DNA分子
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（1）通过 转化dut -双缺 ung 陷大肠杆菌 获得掺U的 M13噬菌 体DNA
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第五章 原核生物基因 表达的调控
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第一节 概述
1，结构简单 2，生长与环境关系密切 3，具有高度的适应性和应变能力
一、原核生物的特点
•生物大分子的合成、终止、及降 解迅速，并受到严格的调控
可嵌入到DNA的碱基对之间
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2，嵌合剂的作用 •其插入可使DNA在 复制时插入一个或两 个碱基；有时导致低 频率的单碱基缺失突 变
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四、转座成分的致突变作用
五、增变基因
1，增变基因定义：某些基因 的突变将造成整个基因组的 突变率明显上升，称为这些 基因增变基因
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•发生基因间抑制突变 的基因
A. tRNA基因 B.与tRNA功能有关的 基因
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（一）基因间无义抑制突变
1，抑制tRNA及其种类
（1）抑制tRNA
（2）无义抑制tRNA的种类
2，琥珀（Amber）型和赭石 （Ochre）型抑制tRNA
2，激活物（activator） •正控制系统中的调节蛋白质
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（二）NH2OH的致突变作 用
（三）烷基化试剂的致突变作用
1，常用的烷基化剂
2，烷基化的主要位点
3，N-7烷基化鸟嘌呤的效应
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三、嵌合剂的致突变作用
1， 丫啶染料分子的特点 •分子均含 丫啶稠环 •分子大小与DNA碱基类似，
一、寡核苷酸引物诱变
2，突变引物的 Nanjing University 合成
•合成一条与正 链互补的含突 变位点的寡核 苷酸引物。引 物长约15 ~ 20个碱基，突 变位点位于中 间
3，异源双链DNA Nanjing University 分子的制备
•在较低温度下将 引物与正链杂交 •在DNA聚合酶I 的Klenow片断 作用下，引物以 正链为模板延伸， 直至合成出全长 的互补链
２，突变基因产物酶活力下降， 造成最终产物减少时，通过 其他基因的突变增加底物， 以提高最终产物的产量
３，突变基因产物酶活力下降，造 Nanjing 成最终产物减少时，通过提高旁路 University 途径，或产生新的生化途径，提高 最终产物的产量 ４，突变基因产物酶活力下降，造 成待分解产物积累时，通过提高下 游途径的效率，或者改变下游途径， 降低因突变基因造成的物质积累 ５，调控区的突变效应可通过改变 调控蛋白质的活力得到抑制
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2，阻遏蛋白（repressor） •负控制系统中的调节蛋 白质
1，正控制系统定义
（二）正控制系统
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•在没有调节蛋白质存在时基因是 关闭的，加入调节蛋白质后基因 表达活性被开启。这样的控制系 统称为正控制系统
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二、原核生物基因表达的调控方式 1， DNA水平的调控 •基因重排 2， 转录水平的调控 •操纵元系统 •时序调控 •以翻译方式调控
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3，翻译水平的调控 •mRNA的二级结构对表达 的调控 •反义RNA的作用 •mRNA的稳定性对翻译的 影响
3，Opal抑制tRNA的特殊性
4，无义抑制tRNA的产生对正 Nanjing 常氨基酸密码子识别的影响 University 5，无义抑制tRNA对翻译的正 常终止的影响
（1）Amber和Opal抑制 tRNA对正常终止影响不大 （2）Ochre抑制tRNA的存在 对细胞有较强的负选择作用
（二）基因间错义抑制突变 Nanjing 1，反密码子突变造成的错义抑制 University （图5-4） 2，tRNA结构其他部分的改变，使 氨酰基-tRNA合成酶错误识别造成 的错义抑制 3，反密码子突变，使氨酰基-tRNA 合成酶错误识别造成的错义抑制 4，氨酰基-tRNA合成酶突变造成的 错义抑制
（2）在异源双 Nanjing University 链DNA分子的 制备过程中， 将形成一条链 含U（未突变 链）而另一条 链不含U（突 变链）的双链 DNA
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（3）将异源双链 DNA分子导入ung+ 宿主中，含U的噬菌 体将不能复制
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2，短的连续重复序列造成 的突变热点 •短的连续重复序列处容易 发生插入或缺失突变 3，不同突变剂造成的突变 热点不同
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第五节 离体定向诱变
（一）定点突变基因的克隆 过程
1，正链DNA的制备 • 通过基因工程方法，构建含 待突变的基因M13重组噬菌 体。制备重组M13噬菌体单 链DNA
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（1）MeC的形 成及脱氨氧化 •胞嘧啶可被甲基 化成为5-甲基
胞嘧 •5-甲基胞嘧可
脱氨氧化成为胸 腺嘧啶
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（2）DNA复制的不同时期 MeC脱氨氧化的后果 •新生链中可被修复
•非复制时期有一半可能发生 突变 •复制时期作为模板链，则将 快速导入突变
四、基因间间接抑制 突变的作用机制
•基因间间接抑制突变： 凡是能够使某一突变 基因产物在一定程度 上完成其使命的其他 基因突变
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１，突变基因产物妨碍了蛋白质 复合体亚基之间的相互作用时， 通过改变与突变基因产物相互作 用的蛋白质的结构，部分恢复蛋 白质复合体的功能
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4，转化宿
主
•用DNA连
接酶切刻连
接，将此双
链DNA导 入大肠杆菌
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5，突变体的筛选 •根据具体情况，采用适 当方法筛选，包括：
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（1）限制位点筛选法 •若定点突变导致了一个限制
性内切酶的引入或消失，则 可通过该限制酶酶切筛选突
（3）重新进 行DNA聚合 反应，产生 出具有定点 突变的双链 DNA分子
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二、PCR诱变法—— 大引物诱变法（megaprimer method of mutagenesis）
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1，第一轮 PCR
•引物：突变
引物 / 短侧
翼引物
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第二节 正控制和负控制
一、正控制（positive control） 系统和负控制（negative control） 系统 （一）负控制系统
1，负控制系统定义
•在没有调节蛋白质存在时基因是表 Nanjing 达的，加入调节蛋白质后基因表达 University 活性被 关闭。 这样的 调控系 统称为 负控制 系统
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第四节 突变剂和突变生成
一、碱基类似物在DNA复制时的渗 入 1， DNA复制时碱基类似物渗 入的结果 2，5-溴尿嘧啶（BU）造成的 碱基转换 3，2-氨基嘌呤（AP）造成的 转换
二、DNA分子上碱基的化学修饰
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（一）亚硝酸引起的氧化脱氨反应 （图5-12） •亚硝酸可使含NH2基的碱基（A、 G、C）氧化脱氨， NH2基变为 酮基 1，腺嘌呤氧化脱氨 2，胞嘧啶氧化脱氨 3，鸟嘌呤氧化脱氨
2，硫代磷酸诱变法
•一些核酸内切限制酶无法切 割硫代磷酸DNA分子 （1）在异源双链DNA分子 的制备过程中加入硫代磷酸， 使新合成的含突变位点的 DNA链硫代磷酸化
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（2）用相应 的核酸内切 限制酶切割 异源双链后， 再由外切核 酸酶局部消 化
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三、基因间抑制突变
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•基因间抑制突变的种类 A.基因间无义抑制突变 （ nonsense suppressor mutation） B.基因间错义抑制突变 （ missense suppressor mutation） C.基因间移框抑制突变 （ frameshift suppressor mutation）
变体
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（2）杂交筛选法 •原理：类似于菌落杂交 •探针：放射性32P标记的含突 变位点的寡聚核苷酸。探针能 与突变体完全配对
•杂交温度：选择探针能与突变 体杂交而不能与野生性分子杂 交的温度
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（3）生物学筛选法
•若定点突变能够产生明显 的生物学表型特征，就可以 使用生物学筛选法。 6，突变基因的鉴定 •通过DNA序列分析对突变 基因进行鉴定
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（二）提高寡核苷酸引物诱 变效率的方法
•异源双链DNA分子是由一条 突变体链和一条非突变体链 组成的，当其在细胞内复制 之后必定会产生出突变体和 非突变体两种子代分子。
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•提高寡核苷酸引物诱 变效率的策略： 去除异源双链中的非 突变链，抑制非突变 体的生长