第七章补料发酵

在流加时间t的培养液体积V为 V=V0 +Ft 则稀释率为:D=F/(V0+Ft) 稀释率对时间的变化率为 dD/dt = -F2/V2=-F2/(V0+Ft)2 V0<<V =Ft 则 dμ/dt= -1/t2 KsF/V 限制性基质的浓度: S= μm- F/V
如限制性基质为能源Yx/s随比生长速率而变化 ,当因生成产物消耗的限制性基质可以忽略.物料 平衡.
+
1
FD
) +1
1 1 SDF+ FSF ( + ) P m A m FD
书上有误提醒
如果SF=SDF 可以将上式简化为: μ D c= Ks+ SF
m
S
F
7.6.1.2 分批培养分批透析 F =FD=0 F,SF S X P V F,S,X,P SDF,FD
SD VD PD
SD,PD
细胞和限制性底物的变化 X S SD 物料平衡 V(XDi-X0) = Yx/s(VS0 +VDSD0) t
当n很大时 P = K*(1- ‫)ץ‬
当放出的培养液开始时浓度较高,随着带 放操作的反复进行逐步减小成为定值.排 放的发酵液大于反应器的体积,从而大大 提高了反应器的利用率和生产效率.
7.6 培养和分离的耦合 如果发酵目的产物或代谢副产物达到一 定浓度时对生产菌有较强抑制作用,可以通 过在培养过程中将这些产物除去, 避免了有 关产物的大量积累,从而改善细胞的生长. 7.6.1 根据反应器和透析器的操作方式可以分为: 连续培养-连续透析、分批培养-分批透析、 分批培养-连续透析和连续培养-分批透析四 种方式。
7.5 补料分批培养 补料分批培养:一种介于分批培养和连续培 养之间的操作方式,在进行分批培养的时候, 向反应器内加入培养基的一种或多种成分, 以达到延长生产期和控制培养过程的目的. 补料分批发酵适用的范围: 1.细胞的高密度培养 2.分解代谢物阻遏培养过程 3.营养缺陷性菌株的培养 4.前体的补充
d(VX)/dt =V dX/dt + X dV/dt
dX/dt = (μ-D)X 同理可以推出: dS/dt = D(SF-S)μX/Y x/s dP/dt =Q pX -DP 连续培养的稀释率和恒速补料稀释率不同 连续培养的稀释率表示因洗掉而被稀释;
恒速补料稀释率:因体积增大而稀释 ~ D ~ X ~ μ ~ S t
μmX+S S (1-p)X- + Ks+S Ks+S = μm-X- +μm + X+ p
p
因此
XX+
(1-p)μm +X+
ⅹ=
=
[(‫+ץ‬p-1) ⅹ0+p](X+/X0+)[‫-1(/ץ‬p)-1]-p ‫+ ץ‬p-1
关于限制性底物,有 1 dX+ 1 dX + -dS/dt = + Y dt Y dt
(2- p )N
μP 2P N F= N+P
N
pP
Fn =
1-‫ - ץ‬p
1 – ‫ - ץ‬p∙2n(‫+ץ‬P-1)
图8-42描绘了上式反映的‫ץ‬和p对F25的影响, 图8-43是培养过程中基因工程菌比例的变化 与‫ץ‬的关系.由于丢失质粒的菌体的生长优势, 一旦发生质粒的丢失,基因工程菌的比例会 迅速下降.
F,SF
SDF,FD
S X P V F,S,X,P
SD VD PD SD,PD
对反应器进行物料平衡 VdX/dt = μXV –FX VdS/dt=F SF+P mAm(S D-S)-FS-μXV/Y x/s
VdP/dt=(ąμ+β )XV- P mAm(P-PD)- FP
对于透析液储罐物料平衡
非透析分批培养 X nd = X0+Yx/sS0 X0忽略不计,进行比较 X Di X nd
= 1+
VDSD0
VS0
由此可见两者之比与限制性底物浓度有关, 和体积有关.如果S0=SD0则: X Di VD = 1+ X nd V
如果底物浓度很底,主要作为能源则最大 细胞浓度为: Pm A m(S D-S) = V mXm
dP/dt =ą
dX+ dt
+ β X+
根据图可以知道分批培养中丢失质粒的 细胞比例逐渐增大,在种子中含有较多丢失基 因工程质粒细胞时尤为严重,从而大大影响产 物的生成.
3).Lee等的结构模型涉及到结构不稳定的 情况.
8.7.2 基因工程菌发酵实例
X,S,P,V
F,SF
Fm,Sm
FF,S,P d(SV) μXV = FS F +F mSm-FFSdt Yx/s
d(PV) = QpXV -FFP dt dV = F+F m-FF dt 如果维持培养液体积不变,F +Fm=FF QpXV FF = P
7.7 基因工程菌的培养 基因工程菌在培养过程中,可能产生不 稳定问题,发生外源基因的丢失或变异,从 而失去外源基因产物的生产性能. 基因工程菌不稳定与菌株的构建、培养 条件密切相关。 7.7.1 脱落性不稳定对发酵的影响 影响基因工程菌不稳定因素很多下 面着重从发酵工程的角度讨论影响工程 菌稳定性的因素。
1 PmA m
X=
+
+ F(SF- μ -D ) m 1
FD + mV
F
YG
透析液罐中的产物浓度 PD= P` m A m P P` m Am +FD (注意改正)
反应器稳态时的产物浓度 (ąF/V +β )XV P=
P` m A m FD
P` m Am +FD
+F
透析液带走的产物在流出反应器的产物 中所占比重为: FDPD = 1+F( P` m Am 1 + 1 ) FD
FDPD + FP
可以看出要使产物主要从透析液中取出,则 应当设法提高P` m Am和FD.这样做会使大量 产物转入无细胞溶液中,但浓度较低对提取 不利.如果产物有抑制作用时可以考虑这种 方法.
如果在临界稀释率DC下操作,反应器的细胞 浓度为0.由此我们可得: μm
Dc=
KS
1 1+F ( P m Am
d(SV)/dt = FSF-1/YG d(VX)/dt –mXV
在拟稳态下:FSF = 1/YG d(VX)/dt+mXV 若在时间tT细胞总量由指数生长转变为线 性增长,这时的细胞浓度和培养液体积分别为XT 和XT将上式积分得: XV=FSF/m – (FSF /m-VTXT)exp[-mYG (t-tT)] 当培养足够长时间FSF/m=XTVT细胞最大量为: (XV)m=FSF/m 这时加入的能源全部用于维持细胞的消耗.
以上模型描述了恒定比生长速率的情 况,但是在发酵过程中限制性基质浓度和菌 体的比生长速率都灰改变,基因工程菌的组 成显示出更复杂的变化. 2).Ollis和 Chang针对质粒丢失提出了一个 模型,并讨论了对产物的影响. dX+ dt = μm
+
S Ks+S
(1-p)X+
dXdt
μm=
dXdX+
7.5.1补料分批培养 补料操作可分为:间歇补料;连续流加. 7.5.1恒速流加 假定:只存在一种限制性基质;细胞的得率不 变. 进行补料分批培养时,由于培养基的加入,培 养液的体积不断变化,整个反应器中细胞,限 制性基质和产物的总量变化规律: d(VX)/dt =μXV d(VS)/dt =FSF -1/Yx/s d(VX)/dt d(VP)/dt =QpVX dV/dt=F
7.6.1.3 分批培养-连续透析 F=0
限制性底物完全 用于维持代谢时, 细胞浓度达到最 大值.
X=
其中 SD =
P mAm(S D-S)
mV P mAmS + FDSDF PmAm +FD
如果FD>>PmAm,那么SDF=SD,则
X=
P mAm(SDF-S)
mV
7.6.2 过滤和培养耦合 物料平衡 d(XV) dt = μXV
VD dS D/dt = FDSDF – FDSD – Pm Am (SD-S) VDdPD/dt = Pm A m(P-PD)- FDPD 达到稳定时μ =F/V= D 在稳态下透析液储罐中的透析液浓度
SD =
FDSDF + P mAmS P mA m +FD
稳态时的细胞浓度
SDF-S
X= 1 + 1 P mA m FD
K= QpXm/(2Dw ) (1- ‫)2ץ‬
或
K= Xm∫Qp(t)(‫+ ץ‬Dwt ) dt
有 P1 =‫ץ‬P0 +K 第二次带放时: P2=‫ץ‬P1 +K=‫2ץ‬P0 + ‫ ץ‬K +K 那么第n次带放时 P n=‫ץ‬nP0 + K (‫ ץ‬n-1 + ‫ ץ‬n-2+ ‫)1+ ץ‬ = ‫ ץ‬n P0 + K 1- ‫ץ‬n 1- ‫ץ‬
+ F(SF-S)
Y x/s
F
KsD
KsD
SDF= μm-D 1 + P mA m FD + F(SF- μ -D ) m 1
Y x/s F
如果限制性基质浓度很低只是当作能源,进行 物料平衡. VdS/dt=F SF+PmAm(S D-S)-FS-(μ/Y G+m )XV 稳态时细胞浓度 KsD SDF- μ -D m KsD
7.5.2 反复补料分批培养 反复补料分批培养:随着补料的进行,培 养液体积不断增大,达到一定程度时,将 部分培养液从反应器中放出,剩下部分继 续进行补料分批培养,如此反复进行. F
V0
Vw V
令: ‫=ץ‬V0/Vw 则 : tw = (1- ‫/)ץ‬DW
D w=F/V w
当Q p不变时 Pw= ‫ץ‬P0+QpXm/(2Dw ) (1- ‫)2ץ‬ 当Q p不是常数时 P w= ‫ץ‬P0+Xm∫Qp(t)(‫+ ץ‬Dwt ) dt 设第一次带放时产物浓度为P1,令
产物的形成,若Q p恒定不变 PV= P0V0+ QpXm(V0+Ft/2)t PV= P0V0 V + QpXm(V0+Ft/2)t V ∫ QpXm(V0+Dt/2)t + V
若Q p不恒定 PV= P0V0
V
7.5.1.2 指数流加 比生长速率保持恒定的情况下: XV=X0V0exp(μt) 以什么样的流加方式保障限制性基质的浓 度 μXV= FY x/s(S F-S) μXV μX0V0exp(μt) = 因此F = Y x/s源自文库S F-S) Y x/s(S F-S)