第十五章现代免疫学技术
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2021/3/3
免疫组织化学的全过程包括：
• 抗原的提取与纯化； • 免疫动物或细胞融合； • 制备特异性抗体以及抗体的纯化； • 将显色剂与抗体结合形成标记抗体； • 标本的制备； • 免疫细胞化学反应以及呈色反应； • 观察结果。
2021/3/3
免疫荧光细胞化学技术
• 免疫荧光细胞化学技术是采用荧光素标记的 已知抗体(或抗原)作为探针，对检测待测组 织、细胞标本中的靶抗原(或抗体)，进行定 位、定性和定量的目的。
• 由于制备材料及工艺不同，现已制成惰性微粒、 活性微粒、磁性微粒及标记微粒等四大类微粒， 数量多达几十种。
• 将制备好的微粒与抗原(或抗体)经物理吸附、化 学偶联及生物素亲合亲桥联法等方法形成免疫微 粒，广泛应用于各种可溶性大分子物质的检测、 分离与纯化、细胞标记与识别等。
• 近年来，微粒技术在核酸分子杂交、DNA与RNA 的分离及PCR等研究领域亦显示出广阔的应用前 景。
10ml干扰素裂解液 （蛋白浓度4mg/ml） 20倍稀释后加入抗体致敏的磁性微球10ml 用50ml PBS洗涤3次 加入甘氨酸-HCl裂解液（pH2.8）20ml 超滤浓缩得纯化α-2b干扰素 收率>60%，纯度>80%， 生物学活性>108 IU/mg
2021/3/3
第二节 免疫组织化学技术
• 免疫组织化学又称免疫细胞化学，是指带显色 剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原 抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原 进行定性、定位、定量测定的一项新技术。
• 它把免疫反应的特异性、组织化学的可见性巧 妙地结合起来，借助显微镜的显像和放大作用 ，在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质。
• 免疫组化技术由免疫荧光技术逐渐发展建立起 高度敏感，且更为实用的免疫酶技术。
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胶乳微粒免疫检测技术
• 胶乳微粒免疫检测技术是在胶乳凝集定性试 验基础上发展建立的一种非放射性均相免疫 测定法，可以对各种微量的抗原物质和小分 子半抗原进行精确的定量测定。
• 根据特异性抗体致敏的胶乳微粒，与待测标 本中的相应抗原相遇时发生凝集反应，胶乳 凝集程度与被测物的浓度呈函数关系，由此 可测出标本中待测物的含量。
• 测定方法主要有粒子计数法和浊度法两种。
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免疫磁性微粒分离与纯化技术
• 磁性微粒(MMS) 是以金属离子为核心，外 层均匀地包裹高分子聚合体的固相微粒。在 液相中，受外加磁场的吸引作用，MMS可 快速沉降而自行分离，无需进行离心沉淀。
• 经过特异性抗体包被制成免疫MMS，与检 样中的抗原结合形成免疫MMS—靶分子(或 靶细胞)复合体，通过外加磁场的作用即可 与其他成分分离开来。再以适当方式使复合 体解离，在磁场吸引下除去游离的免疫 MMS，即可获得纯化的靶分子或细胞。
以确定组织中是否存在某种抗原。
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第三节 免疫电子显微镜技术
• 免疫电镜技术(Immune electron microscopy ，IEM)是将抗原抗体反应的特异性与电子显 微镜的高分辨力相结合，在亚细胞和超微结 构水平上对抗原物质进行定位分析的一种高 度精确、灵敏的方法。
• 特异性抗体用电子致密物质，如铁蛋白、胶 体金等标记后，使之与组织超薄切片中的抗 原结合，在电镜下观察到标记物所在位置， 即为抗原抗体反应的部位。
• 而且HRP的分子量(40kDa)比铁蛋白 (750kDa)将近小20倍，酶标抗体较易透过经 适当处理后的组织细胞膜，能用于定位细胞 内抗原。
• 但酶反应产物的分辨率不如颗粒性标记物(铁 蛋白胶体金)高。
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免疫电镜技术常用标记原理 I
铁蛋白标记
• 铁蛋白是一种含铁23％，分子量约750kDa，直径 为12—14nm的球形蛋白。
• 其核心是由4个亚基组成的高电子密度氢氧化铁胶 态分子团，外层由24个蛋白质亚单位组成近似球形 的外壳。
• 在电镜下，铁很容易和其他粒子相区别，显像清晰 。可通过双功能交联剂可与抗体、SPA等共价结合 ；用于免疫电镜检测的优点是标记物呈颗粒状，分 辨率高。
• 但其缺点是Fe的分子量太大，难以透过细胞膜和组 织，只适用于细胞表面抗原定位；而且Fe染色标本 只适合电镜检查，不能用普通光学显微镜观察。
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酶标记
• 将酶标抗体用于免疫组化技术，以HRP标记 抗体，通过H2O2／DAB底物系统被酶分解的 呈色反应，来显示抗原抗体反应部位。
• DAB分解产物为不溶性的棕色吩嗪衍生物， 经过OsO4处理后变黑，具有高电子密度，十 分适合于电镜观察。
• 免疫荧光技术虽已广泛应用于免疫学的研究 与诊断，为免疫病理研究开辟了一条新途径 。
• 另外，酶显色产物具有较高的电子密度，经 过适当处理还可以进行免疫电镜观察
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抗体与靶抗原结合之后，形成的抗原抗体复合物在显微 镜下是不可见的，如将抗体与某种显色剂偶联，抗原与 抗体结合形成的复合物就由不可见而成为可见，从而可
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免疫酶细胞化wenku.baidu.com技术
• 免疫酶技术就是用酶标记已知抗体(或抗原) ，然后与组织标本在一定条件下反应，如果 组织中含有相应抗原(或抗体)，抗原抗体相 互结合形成的复合物中所带酶分子遇到底物 时，能催化底物水解、产生显色反应，识别 出标本抗原(抗体)分布的位置和性质，通过 图像分析并可达到定量的目的。
第十五章现代免疫学技术
第一节 免疫微粒技术
• 免疫微粒技术是利用高分子材料合成 一定粒度大小的固相微粒作为载体， 包被上具有特异性亲和力的各种免疫 活性物质(抗原或抗体)，使其致敏为 免疫微粒，用于免疫学及其他生物学 检测与分离的一项技术。
2021/3/3
• 作为载体的微粒通常是以某种高分子有机单体为 原料经过高分子聚合方法制备而成。
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免疫微粒技术
2021/3/3
免疫磁性分离原理示意图
• 细胞裂解液 • 浓度调整 • 免疫磁性微球吸附 • 洗涤 • 解离 • 超滤 • 凝胶过滤 • α-2b干扰素纯品
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磁铁
细胞裂解液
免疫磁性微球 α-2b干扰素 杂蛋白
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基因工程α-2b干扰素的 免疫磁性分离系统的开发
免疫组织化学的全过程包括：
• 抗原的提取与纯化； • 免疫动物或细胞融合； • 制备特异性抗体以及抗体的纯化； • 将显色剂与抗体结合形成标记抗体； • 标本的制备； • 免疫细胞化学反应以及呈色反应； • 观察结果。
2021/3/3
免疫荧光细胞化学技术
• 免疫荧光细胞化学技术是采用荧光素标记的 已知抗体(或抗原)作为探针，对检测待测组 织、细胞标本中的靶抗原(或抗体)，进行定 位、定性和定量的目的。
• 由于制备材料及工艺不同，现已制成惰性微粒、 活性微粒、磁性微粒及标记微粒等四大类微粒， 数量多达几十种。
• 将制备好的微粒与抗原(或抗体)经物理吸附、化 学偶联及生物素亲合亲桥联法等方法形成免疫微 粒，广泛应用于各种可溶性大分子物质的检测、 分离与纯化、细胞标记与识别等。
• 近年来，微粒技术在核酸分子杂交、DNA与RNA 的分离及PCR等研究领域亦显示出广阔的应用前 景。
10ml干扰素裂解液 （蛋白浓度4mg/ml） 20倍稀释后加入抗体致敏的磁性微球10ml 用50ml PBS洗涤3次 加入甘氨酸-HCl裂解液（pH2.8）20ml 超滤浓缩得纯化α-2b干扰素 收率>60%，纯度>80%， 生物学活性>108 IU/mg
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第二节 免疫组织化学技术
• 免疫组织化学又称免疫细胞化学，是指带显色 剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原 抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原 进行定性、定位、定量测定的一项新技术。
• 它把免疫反应的特异性、组织化学的可见性巧 妙地结合起来，借助显微镜的显像和放大作用 ，在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质。
• 免疫组化技术由免疫荧光技术逐渐发展建立起 高度敏感，且更为实用的免疫酶技术。
2021/3/3
胶乳微粒免疫检测技术
• 胶乳微粒免疫检测技术是在胶乳凝集定性试 验基础上发展建立的一种非放射性均相免疫 测定法，可以对各种微量的抗原物质和小分 子半抗原进行精确的定量测定。
• 根据特异性抗体致敏的胶乳微粒，与待测标 本中的相应抗原相遇时发生凝集反应，胶乳 凝集程度与被测物的浓度呈函数关系，由此 可测出标本中待测物的含量。
• 测定方法主要有粒子计数法和浊度法两种。
2021/3/3
免疫磁性微粒分离与纯化技术
• 磁性微粒(MMS) 是以金属离子为核心，外 层均匀地包裹高分子聚合体的固相微粒。在 液相中，受外加磁场的吸引作用，MMS可 快速沉降而自行分离，无需进行离心沉淀。
• 经过特异性抗体包被制成免疫MMS，与检 样中的抗原结合形成免疫MMS—靶分子(或 靶细胞)复合体，通过外加磁场的作用即可 与其他成分分离开来。再以适当方式使复合 体解离，在磁场吸引下除去游离的免疫 MMS，即可获得纯化的靶分子或细胞。
以确定组织中是否存在某种抗原。
2021/3/3
第三节 免疫电子显微镜技术
• 免疫电镜技术(Immune electron microscopy ，IEM)是将抗原抗体反应的特异性与电子显 微镜的高分辨力相结合，在亚细胞和超微结 构水平上对抗原物质进行定位分析的一种高 度精确、灵敏的方法。
• 特异性抗体用电子致密物质，如铁蛋白、胶 体金等标记后，使之与组织超薄切片中的抗 原结合，在电镜下观察到标记物所在位置， 即为抗原抗体反应的部位。
• 而且HRP的分子量(40kDa)比铁蛋白 (750kDa)将近小20倍，酶标抗体较易透过经 适当处理后的组织细胞膜，能用于定位细胞 内抗原。
• 但酶反应产物的分辨率不如颗粒性标记物(铁 蛋白胶体金)高。
2021/3/3
免疫电镜技术常用标记原理 I
铁蛋白标记
• 铁蛋白是一种含铁23％，分子量约750kDa，直径 为12—14nm的球形蛋白。
• 其核心是由4个亚基组成的高电子密度氢氧化铁胶 态分子团，外层由24个蛋白质亚单位组成近似球形 的外壳。
• 在电镜下，铁很容易和其他粒子相区别，显像清晰 。可通过双功能交联剂可与抗体、SPA等共价结合 ；用于免疫电镜检测的优点是标记物呈颗粒状，分 辨率高。
• 但其缺点是Fe的分子量太大，难以透过细胞膜和组 织，只适用于细胞表面抗原定位；而且Fe染色标本 只适合电镜检查，不能用普通光学显微镜观察。
2021/3/3
酶标记
• 将酶标抗体用于免疫组化技术，以HRP标记 抗体，通过H2O2／DAB底物系统被酶分解的 呈色反应，来显示抗原抗体反应部位。
• DAB分解产物为不溶性的棕色吩嗪衍生物， 经过OsO4处理后变黑，具有高电子密度，十 分适合于电镜观察。
• 免疫荧光技术虽已广泛应用于免疫学的研究 与诊断，为免疫病理研究开辟了一条新途径 。
• 另外，酶显色产物具有较高的电子密度，经 过适当处理还可以进行免疫电镜观察
2021/3/3
抗体与靶抗原结合之后，形成的抗原抗体复合物在显微 镜下是不可见的，如将抗体与某种显色剂偶联，抗原与 抗体结合形成的复合物就由不可见而成为可见，从而可
2021/3/3
免疫酶细胞化wenku.baidu.com技术
• 免疫酶技术就是用酶标记已知抗体(或抗原) ，然后与组织标本在一定条件下反应，如果 组织中含有相应抗原(或抗体)，抗原抗体相 互结合形成的复合物中所带酶分子遇到底物 时，能催化底物水解、产生显色反应，识别 出标本抗原(抗体)分布的位置和性质，通过 图像分析并可达到定量的目的。
第十五章现代免疫学技术
第一节 免疫微粒技术
• 免疫微粒技术是利用高分子材料合成 一定粒度大小的固相微粒作为载体， 包被上具有特异性亲和力的各种免疫 活性物质(抗原或抗体)，使其致敏为 免疫微粒，用于免疫学及其他生物学 检测与分离的一项技术。
2021/3/3
• 作为载体的微粒通常是以某种高分子有机单体为 原料经过高分子聚合方法制备而成。
2021/3/3
免疫微粒技术
2021/3/3
免疫磁性分离原理示意图
• 细胞裂解液 • 浓度调整 • 免疫磁性微球吸附 • 洗涤 • 解离 • 超滤 • 凝胶过滤 • α-2b干扰素纯品
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磁铁
细胞裂解液
免疫磁性微球 α-2b干扰素 杂蛋白
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基因工程α-2b干扰素的 免疫磁性分离系统的开发