植物表达载体构建

卸甲载体（disarmed vector） 1．Onc-卸甲载体： 所谓的卸甲载体就是无毒的（ non-oncogenic）、即切 除了 Onc 致瘤基因的 Ti 质粒载体。在这种 Onc- 载体中，已 经缺失的T-DNA部位被大肠杆菌的一种常用质粒pBR322取 代。这样，任何适合于克隆在质粒中的外源DNA片段，都 可以通过与 pBR322 质粒 DNA 的同源重组，而被共整合到 Onc-Ti质粒载体上。最常用的 Onc-卸甲载体为pGV3850， 它保留了两个边界和右边界附近的 nos基因（胭脂碱合成酶 基因），可作为鉴别转化细胞的一个标记； T-DNA内部的 Onc 缺失 区被 pBR322 序 列（ 含 Apr 基 因 ）所取 代 。插入 pBR序列可供卸甲载体和中间载体之间实现交换重组形成 共和体，即重组体。 2. Onc+卸甲载体： 不去除Onc基因的卸甲载体，用于特殊用途。
第多种转化系统， 如载体转化系统、原生质体DNA直接导入转化系统、基因 枪DNA导入转化系统，以及利用植物种质细胞如花粉粒等介 导转化系统等等。 其中的载体转化系统是植物基因工程中最重要的一种转化 系统。 载体转化系统中最重要的又是Ti质粒转化载体。
一．植物基因工程载体种类及命名规则： 二．根癌农杆菌Ti质粒的结构和功能： （一）Ti质粒的遗传特性、结构及功能： （二）T-DNA的基因结构与功能： 三．农杆菌Ti质粒的基因转化机理： （一）T-DNA的加工和转移： （二）T链蛋白复合体的形成及VirE的功能： （三）T链复合体通过细菌膜的转运及VirB的功能： （四）T链复合体靶向植物细胞核： （五）T链整合植物基因组的分子机理： （六）农杆菌染色体基因对T-DNA转移的调控： 四．农杆菌Ti质粒的改造及载体构建： （一）Ti质粒的改造及卸甲载体构建： （二）中间载体的构建： （三）中间表达载体的构建： （四）植物基因转化载体系统的构建： （五）载体构建中常用的选择基因和报告基因
（五）T链整合植物基因组的分子机理： 1．整合位点及其特性：
遗传作图的分析表明， T-DNA 在植物染色体上的插 入是随机的，可插入任何一条植物染色体。但插入位点 常有以下特点：① T-DNA 优先整合到转录活跃的植物基 因位点；②T-DNA与植物DNA连接处富含A、T碱基对；③ 植物DNA上的插入靶位点与T-DNA边界序列有一定程度的 同源性。Matsumoto等人认为，正是由于这种同源性才 使得插入的T-DNA和靶序列能互相靠近，并有效地发生 DNA链的交换。 在 T-DNA 的整合过程中还常发现植物基因组靶序列 的缺失、倒位和重复等现象，说明T-DNA的整合过程依 赖于植物内源重组系统。
四．农杆菌Ti质粒的改造及载体构建
（一）Ti质粒的改造及卸甲载体构建：
（二）中间载体的构建： 1．中间载体的基本结构与特点 2．常用的中间载体及其构建 1．中间载体的基本结构与特点： 为解决Ti质粒不能直接导入目的基因的困难，构建中 间载体是有效方法之一。中间载体是在大肠杆菌的克隆 载体（例如pBR322质粒）中插入一段合适的 T-DNA片段 而构成的小型质粒。中间载体通常是多拷贝的E.Coli小质 粒。 从结构特点上看，中间载体可分为两类： 共整合系统中间载体 双元载体系统中间载体
（五）T链整合植物基因组的分子机理： 1．整合位点及其特性 2．T-DNA整合的遗传效应： 位点效应：T-DNA可插入多个物理位点。遗传位点数一般少 于或等于插入的物理位点数，这是因为甲基化可使基因不表 达；或者，多拷贝插入不同位点或首尾串联在一起，可能相 互 起 作 用 而 导 致 基 因 的 沉 默 （ 被 称 为 共 抑 制 ， cosuppression）。 T-DNA的插入一般不引起植物 DNA大的重排，但多数插入 会导致靶位点处出现小的缺失，缺失多的可达79个核苷酸。 在 T-DNA/ 植 物 DNA 连接处 ， 有几个至 33 个核苷 酸 的 “填 充”DNA（Filler DNA）的存在，这些填充DNA的序列与靠 近连接处的植物DNA序列相似。 在植物靶位处不要求有特异的序列，但若在 T-DNA两端和 植物靶位处之间有一段序列（5-10bp）同源，则可在整合中 起作用。
四．农杆菌Ti质粒的改造及载体构建
（一）Ti质粒的改造及卸甲载体构建 （二）中间载体的构建 （三）中间表达载体的构建 （四）植物基因转化载体系统的构建 （五）载体构建中常用的选择基因和报告基因
（一）Ti质粒的改造及卸甲载体构建： 由于大肠杆菌具有能与农杆菌高效接合转移的特性， 科学家们可以先把 T-DNA 片段克隆到大肠杆菌的质粒中， 并插入外源基因，最后通过接合转移把外源基因引入到农 杆菌的Ti质粒上。带有重组T-DNA的大肠杆菌质粒称为中 间载体（ intermediate vector ），而接受中间载体的 Ti 质 粒称为受体Ti质粒（acceptor Ti plasmid），一般是卸甲 载体（disarmed vector）。
（六）农杆菌染色体基因对T-DNA转移的调控： 目前已发现位于细菌染色体上的一些基因也与 T-DNA 的转移有关，并已经了解它们编码的蛋白质的功能。 ChrA、ChrB和ChrC均参与细菌的附着功能。还有一些 基因（ Cel 、 Att 、 ivr 、 PscA 和 ExoC 等）在 T-DNA 转移 中起重要作用，这些基因的突变将使细菌表面成分发生 变化，从而丧失与植物细胞识别和结合的的能力。此外， ChrD 位点影响 AS 对毒性区的诱导效率和农杆菌的致瘤 能力。这是因为ChrD可能编码一种细菌ATP结合蛋白， 在低 pH 值和磷酸饥饿的情况下可诱导 VirG 的表达。 ChrE位点编码一个单糖结合蛋白，与单糖影响 Vir区的 表达有关。Ros基因与Vir基因的负调节有关。可见，目 前已知农杆菌染色体上游 10个基因与T-DNA的转移有关。