小鼠脚趾DNA提取以及基因型鉴定

小鼠脚趾DNA提取以及Macf1fl/flC57BL/6-Prrx1-Cre小鼠

基因型鉴定

张茹

2016年3月15日

一．小鼠脚趾DNA提取

【原理】

1.提取过程

真核生物的DNA是以染色体的形式存在于细胞核内，因此，制备DNA的原则是即要将DNA与蛋白质、脂类和糖类等分离，又要保持DNA分子的完整。提取DNA的过程是将动物组织在含SDS（十二烷基硫酸钠）和蛋白酶K的消化液中消化分解蛋白质，再用酚抽提分离蛋白质，得到的DNA溶液经乙醇沉淀使DNA析出来。

2.裂解液各成分作用

在匀浆后提取DNA的反应体系中，SDS可使蛋白变性并溶解细胞膜中的脂质，从而使细胞裂解，并使组织蛋白与DNA分离。EDTA可以整合镁离子，这样将会抑制细胞中Dnase的活性；因为该酶必须在有镁离子存在下才会起作用。蛋白酶K的重要特性是能在SDS和EDTA（乙二胺四乙酸二钠）存在下保持很高的活性。并且可将蛋白质降解成小肽或氨基酸，使DNA分子完整地分离出来。

3.Tris苯酚作用

酚是非极性分子，水是极性分子，当蛋白水溶液与酚混合时，蛋白质分子之间的水分子就被酚挤去，使蛋白失去水合状态而变性。经过离心，变性蛋白质的密度比水的密度为大，因而与水相分离，沉淀在水相下面，从而与溶解在水相中的DNA分开。而酚作为有机溶剂比重更大，保留在最下层。

【实验材料】

1.耗材

1.5ml离心管，水浴锅，高速冷冻离心机，1ml移液枪，200ul移液枪，通风橱，1ml移液枪枪头，200ul移液枪枪头。

2.试剂

Tris-HCl，EDTA，NaCl，SDS，灭菌水，Tris苯酚，无水乙醇，75％乙醇，1倍

TE缓冲液

【实验步骤】

1.SNET裂解液（50ml）：100mM Tris-HCl（10ml，PH8.0），

200mM EDTA（1.25ml PH8.0），

1M NaCl（20ml），

10% SDS（5ml），

水（13.75ml）。

（裂解液在常温下结晶，使用之前在55℃水浴锅中预热）

蛋白酶K（PK）：储存浓度：10mg/ml；终浓度：100ug/ml

2、操作步骤：

1)小鼠标记编号，并收集小鼠脚趾样品于1.5mlEP管中（提前高压灭菌）。

2)提前准备55℃水浴锅，并把4℃离心机打开（300rmp离心降温至4℃）。

3)往装有小鼠脚趾组织的EP管里加入400ul Snet裂解液，4ul 蛋白酶K（实验

经验，充分消化可加6-7ul），其浓度是10mg/ml，即终浓度为100ug/ml；

4)置于55℃水浴锅中裂解1h（实验经验，充分裂解需2.5-3.5h）；

5)待组织裂解完后，在通风厨中加入400ul Tris饱和酚（除去蛋白质杂质），剧

烈震荡20s（实验经验，剧烈震荡100多次），至呈乳浊液；

6)12,000g，4℃，离心10min（所有管子方向一致）；

7)吸取上清330-390ul于新的EP管中（缓慢吸取，勿吸到蛋白层），加二倍体

积的无水乙醇（即660-780ul），轻摇出现白色絮状沉淀（轻摇100多次，充分混匀）；

8)同第五步离心后，用1ml枪头一次吸取上清，留剩余刚好淹没沉淀；

9)加1ml 75%乙醇，12,000g ，4℃离心5min；

10)用1ml枪头一次吸取上清，留剩余刚好淹没沉淀；

11)12,000g ，4℃离心3min；

12)用200ul枪吸干上清（在沉淀对面吸取），通风橱中晾干；

13)根据沉淀量多少加20~50ul无菌水溶解DNA沉淀，吸吹10~15次，混匀。

二．Macf1fl/fl C57BL/6-Prrx1-Cre小鼠的基因型鉴定

1.鉴定原理

鉴定Macf1fl/flC57BL/6-Prrx1-Cre小鼠的基因型，要基于本小鼠构建的原理。

本小鼠模型构建基于Cre/LoxP系统的条件性基因敲除技术，即在组织或细胞特异性Cre重组酶转基因小鼠的作用下，实现在特定细胞及特定发育阶段敲除目的基因研究其功能。

本研究在骨髓间充质干细胞的标记分子Prrx1基因中插入Cre基因，即构建为Prrx1-Cre小鼠，特异性的表达Cre酶。LoxP位点标记MACF1基因片段，即构建为MACF1-Flox小鼠。这两种小鼠交配，使得Cre基因被可诱导的Prrx1启动子控制，通过诱导表达Cre重组酶而将LoxP位点之间的MACF1基因切除，从而繁殖得到骨髓间充质干细胞中特异性敲除MACF1基因的小鼠。

通过设计引物，pcr扩增片段长度，判断子代小鼠是否插入LoxP位点，以及是否插入Cre位点，从而鉴定子代小鼠基因型。

Cre重组酶敲除LoxP修饰位点的过程

2. 鉴定方案及鉴定图

2.1Macf1打靶的基因型鉴定

2.1.1 引物设计位点

引物设计在LoxP插入的基因片段上，LoxP位点长34bp，野生型片段片段长700bp，含LoxP位点的片段长750bp。

2.1.2 PCR引物序列信息

2.1.3 PCR反应程序

2.1.4 鼠尾DNA的基因型鉴定结果

若只能扩增得到700bp条带，说明小鼠是野生型；若只能得到750bp条带，说明是纯合子小鼠；若能得到700bp和750bp两个条带，说明是杂合子小鼠。

2.2 Prrx1-iCre的基因型鉴定：

2.2.1 引物设计位点

鉴定是否含Cre基因。需要两种引物，一种用来扩增野生型的短片段，一种用来扩增突变型的长片段。WT-F/R设计在基因组上，用于扩增野生型产物(267bp)；Mut-R引物设计在Cre上，WT-F/Mut-R引物用来扩增突变型产物(322bp)。