硝化细菌富集方法的研究
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图 2 氨氮浓度与氨氮降解率的关系
从图 2 可见氨氮降解率随 NH4 + - N 浓 度增 加 而 加 快 , 但 在 NH4 + - N 浓 度 超 过 20010mg/L 时 氨 氮 降 解 率 增 加 不 明 显 , 因 此 , 通过测定 NH4 + - N 在一定时间内的降 解率 , 随时调节培养基中 NH4 + - N 浓度有 利于硝化细菌的培育 。 212 有机物浓度对氨氮降解率的影响
采用 摇 床 培 养 和 间 歇 曝 气 培 养 两 种 方 式 。设 置 摇 床 培 养 的 条 件 28 ℃, 120rpm/ min ; 间歇曝气培养装置及流程如图 1 。底 泥按 15 % (v/ v) 接种于硝化细菌富集培养 基 , 每天检测 NO2 - 、NO3 - 的产生及 NH4 + 的消耗 , 用 20 %NaOH 调 pH 至 710 - 815 , 定期补充培养基 。
保持 NH4 + - N 浓度为 5010mg/ L , 其它条 件不变的情况下 , 通过加入葡萄糖改变培养基 中有机物浓度 , 观察到氨氮降解率如图 3。
可见随有机物浓度的增加氨氮降解率反 而明显下降 。这是因为有机物的增加导致异 养菌大量繁殖 , 相应抑制了自养菌的生长 。 因此 , 在进行硝化细菌富集培养时 , 有机物 浓度应保持在较低水平 , 保持一定量的有机 物存在有助于自养菌的依附和有利于硝化污 泥的形成 。
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© 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
菌 , 以提高测菌时的出菌率 。 11412 硝化细菌计数
取灭菌 96 孔平板 (8 ×12) , 每一小孔 加入 0101ml 亚硝化细菌富集培养基 , 用微 量吸管取 0101ml 经处理的样品 , 分别加入 第一列每一个小孔 , 混匀 , 再取出 0101ml 混合样品加入第二排的小孔 , 依次做倍比稀 释至第 12 列的小孔 , 其结果是每一测定样 品做了 8 次平行 12 次倍比稀释 。将接种好 的平板放入铺有湿纱布的瓷盘 , 28 ℃培养 20d , 供硝化细菌计数用 。分别用格氏试剂 和二苯胺试剂判定结果 , 出现红色者 , 为亚 硝化细菌阳性者 , 出现兰色者 , 为硝化细菌 阳性者 。本实验中只要有红色或兰色出现 , 都作为硝化菌阳性 。根据出现的阳性小孔 , 查相关的 MPN 指数表 , 再换算成 1ml 污泥 样品中含硝化细菌的菌数 。 115 培养装置
会编 1 水和废水监测分析方法 1 北京 : 中国环境科学 出版社 , 1989 : 254 - 354 [6 ] 金志刚 , 屈计宁 1 硝化细菌富集技术分析及方法研究 1 上海环境科学 1998 , 8 : 16 - 19
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图 1 间歇培养装置示意图
116 指标的测定[5] 定量分析 : COD 测定 : 重铬酸钾法 ; NH4+ - N 的测定 : 钠氏比色法。
定性分析 : NH4+ - N , 采用奈氏试剂检 测 ; NO2 - , 采用格里斯试剂检测 ; NO3 - 采 用锌 - 碘 - 淀粉试剂检测 ;
2 结果与讨论 211 氨氮浓度对氨氮降解率的影响
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(MLSS) 计算出利用这两种污泥进行氨氮降 解的速率 ( K) 分别为 : K1 = 1168mg (NH4 + - N) / g (MLSS) ·h ; K2 = 1102 mg (NH4 + - N) / g (MLSS) ·h 从测定的结果看 , 两种 富集方式都具有明显的氨氮降解特性 , 这一 结果与金志刚等的实验结果有相似之处[6] , 但摇床富集培养的效果比间歇曝气培养方式
水中溶解氧的高低影响到好氧厌氧微生 物的比例 , 大多数学者认为 DO 应控制在 115 - 210mg/ L , 低于 015mg/ L 硝化作用明显 减弱 。同时在硝化过程中保持一定的泥令 , 合适的碳氮比对硝化及脱氮均有影响 。因 此 , 根据以上种种分析 , 我们控制富集培养 的环境条件为温度 28 - 30 ℃, pH710 - 815 , 底泥与培样液的比为 15 % (v/ v) , DO 大于 210mg/ L 。 114 硝化细菌的计数方法[4] 11411 样品处理
氨氮降解率大体能反映硝化细菌的活性 和数量 , 探讨氨氮浓度对氨氮降解率的影响 可以明确富集培养基中氨氮的加入量 。实验 选择摇床培养 4 周的硝化活性污泥进行 。取 6 份相同量的硝化污泥 , 经离心 , 加入培养 基 , 使培养基中 NH4 + - N 浓度分别为 5010 、 10010 、15010 、20010 、25010 、30010mg/ L , 经 28 ℃, 120rpm 摇床培养 , 24h 后取样重新 测定 NH4 + - N 浓度 , 计算出相应的氨氮降 解率 , 将结果绘制成图 (见图 2) 。
《淡水渔业》2000 年第 30 卷第 9 期
硝化细菌富集方法的研究
李 谷
黄 正 范 玮 刘红艳
(中国水产科学研究院长江水产研究所 434000) (同济医科大学环境医学研究所 430400)
在集约化养殖水体中有机物和 “三氮” 的浓度往往明显增加 , 随着有机物的增加 , 异氧微生物得以大量繁殖 , 而自养微生物如 硝化细菌由于其自身的特点 : 自养性 、好氧 性 、生长速度慢 、依附性和产酸性 , 在水体 中的数量受到相对抑制 。据调查研究表明 , 在人工控温养鳖池水体中硝化细菌的数量仅 为 13 (MPN) / ml[1] , 如此低的硝化细菌的 存在直 接 影 响 到 硝 化 效 果 和 生 物 脱 氮 的 效 率 , 容易导致 NH4 + - N 浓度升高 。一般情 况下 , 废水中硝化细菌的浓度与硝化速率成 正比 。因此 , 提高硝化细菌的浓度对降解养 殖水体中氨氮具有十分重要的意义 。目前 , 国外已有硝化细菌培养方面的技术专利 , 其 中一些已形成工业化生产 , 但产品价格较 贵 。因此 , 研究并开发经济实用的硝化细菌 富集技术 , 提高硝化细菌的产率 , 对养殖废 水中氨氮的降解尤为重要 。本文旨在通过两 种不同的方法 , 探讨了富集培养硝化细菌的 途经 , 并得到了富含硝化细菌且价格低廉的 活性污泥样品 。 1 材料和方法 111 污泥样品
取自长江水产研究所甲鱼养殖基地排污 口底泥 , 培养前用沙布去除样品中的沙粒 。 112 硝化细菌富集培养基的主要成分[2]
(NH4 ) 2SO4 5g ; MgSO4 ·7H2O 015g ; NaCl 2g ; FeSO4 ·7H2O 0104g ; MnSO4 ·4H2O
0101g ; K2HPO4 1g ; CaCO3 5g ; H2O 1000mL ; pH 712 ; 灭菌 。 113 培养条件的确定[3]
33 (3) : 675 [4 ] 王家玲主编 1 环境微生物学实验 1 北京 : 高等教育出
版社 , 1988 : 40 - 44 [5 ] 国家后步环境保护局《水和废水监测分析方法》编委
保持 pH 值 712 - 815 , 对硝化细菌的富集培 养非常重要 ; 保持适当的 COD/ N 比例 , 随 时调整培养基中的 NH4 + - N 浓度这些因素
温度对硝化细菌的生长速率和硝化速度 都有较大影响 。大多数硝化细菌的合适生长 温度为 15 - 35 ℃, 温度对硝化速率的影响 可表 示 为 , μ = μ0θ(T- 20) , 式 中 T 为 温 度 ( ℃) , θ为温度系数 。
pH 值对硝化细菌的影响多数人认为亚 硝化细菌为 710 - 815 , 硝化细菌为 615 715 , 同时 , 硝化作用伴随着产酸会使 pH 值 降低 , 因此调节 pH 值保持在适宜的范围对 硝化细菌的培养非常重要 。
培养前 硝化菌 异养菌
第4周 硝化菌 异养菌
第8周 硝化菌 异养菌
第 12 周 硝化菌 异养菌
摇床培养
13
曝气培养
13
812 ×106 812 ×106
614Leabharlann Baidu×104 417 ×104
219 ×107 312 ×107
212 ×108 416 ×107
614 ×106 218 ×106
500ml 的人工配水 , 在相同条件下曝气 , 24h 数量的比较
后采样测定氨氮浓度结果 。根据公式 Kn =
两种富集培养方式在不同培养阶段硝化
Co ( NH4 + - N ) - Ct ( NH4 + - N ) / T 1 O 细菌和异养菌数量计数结果见表 1 。
表 1 硝化细菌和异养菌数量计数结果
式 , 经 12 周的培养均获得硝化细菌占绝对 优势的硝化污泥 , 而异养菌则降到较低水 平 。计数结果硝化细菌 516 ×1010 MPN/ ml 和 419 ×109 MPN/ ml , 异养菌 713 ×103 CPU/ ml 和 811 ×103 CPU/ ml ; 同时 , 在培养过程中
[3 ] Rowe R et al1Microtechnique for Most - Probable - Number Analysis。Applied and Environmental Microboilogy , 1977 ,
取上述两种样品污泥各 1ml , 分别加入 到装有 99ml pH 为 712 的磷酸盐缓冲液的 100ml 烧杯中 , 用 CSP - 2 型超声波发生器 震荡 1min , 充分分散包埋在菌胶团中的细
3 本文为农业部重点科研项目“应用微生物改善集约化养殖水体的研究”的部分内容 。 收稿日期 :2000 - 05 - 08
采用 摇 床 培 养 和 间 歇 曝 气 培 养 两 种 方
参考文献
[1 ] 李谷 , 运珞珈 1 人工养鳖池水质的理化特征和细菌状 态的研究 1 湖北农学院学报 , 2000 , 2 : 157 - 160
[2 ] 俞毓磬主编 1 环境工程微生物检验手册 1 北京 : 中国 环境科学出版社 , 1990 : 135 - 136
ml 和 419 ×109 MPN/ ml , 而异养菌为 713 × 103 CPU/ ml 和 811 ×103 CPU/ ml ; 得到的活
学研究室王家玲教授和运珞珈副教授的悉心指导 , 特此致谢 !
性污泥中硝化细菌成为绝对优势菌种 , 采用 摇床富集培养比间歇曝气富集培养硝化细菌 数量的增加更为明显 。 3 结论
516 ×1010 419 ×109
713 ×103 811 ×103
硝化菌 MPN/ ml , 自养菌 CPU/ ml
从表 1 可以看出 , 培养 12 周后两种富 对硝化细菌的富集培养也不可忽视 。
集培养方式硝化细菌数量为 516 ×1010 MPN/
致谢 : 本研究得到同济医科大学环境微生物
更好 ; pH 值变化在摇床富集培养的硝化污
泥中也更为明显 , 基本上需要每天都进行调
图 3 有机物浓度与氨氮降解率的关系
节 , 表明硝化反应在该体系进行得更为完
213 两种富集培养方式的比较
全 。其可能的原因会不会是溶氧的差异所
分别取经过连续富集培养 6 周的污泥各 致 , 尚值得探讨 。
200ml , 离心后置于 1L 的锥形瓶中 , 再加入 214 两种富集培养方式硝化细菌和异养菌
从图 2 可见氨氮降解率随 NH4 + - N 浓 度增 加 而 加 快 , 但 在 NH4 + - N 浓 度 超 过 20010mg/L 时 氨 氮 降 解 率 增 加 不 明 显 , 因 此 , 通过测定 NH4 + - N 在一定时间内的降 解率 , 随时调节培养基中 NH4 + - N 浓度有 利于硝化细菌的培育 。 212 有机物浓度对氨氮降解率的影响
采用 摇 床 培 养 和 间 歇 曝 气 培 养 两 种 方 式 。设 置 摇 床 培 养 的 条 件 28 ℃, 120rpm/ min ; 间歇曝气培养装置及流程如图 1 。底 泥按 15 % (v/ v) 接种于硝化细菌富集培养 基 , 每天检测 NO2 - 、NO3 - 的产生及 NH4 + 的消耗 , 用 20 %NaOH 调 pH 至 710 - 815 , 定期补充培养基 。
保持 NH4 + - N 浓度为 5010mg/ L , 其它条 件不变的情况下 , 通过加入葡萄糖改变培养基 中有机物浓度 , 观察到氨氮降解率如图 3。
可见随有机物浓度的增加氨氮降解率反 而明显下降 。这是因为有机物的增加导致异 养菌大量繁殖 , 相应抑制了自养菌的生长 。 因此 , 在进行硝化细菌富集培养时 , 有机物 浓度应保持在较低水平 , 保持一定量的有机 物存在有助于自养菌的依附和有利于硝化污 泥的形成 。
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菌 , 以提高测菌时的出菌率 。 11412 硝化细菌计数
取灭菌 96 孔平板 (8 ×12) , 每一小孔 加入 0101ml 亚硝化细菌富集培养基 , 用微 量吸管取 0101ml 经处理的样品 , 分别加入 第一列每一个小孔 , 混匀 , 再取出 0101ml 混合样品加入第二排的小孔 , 依次做倍比稀 释至第 12 列的小孔 , 其结果是每一测定样 品做了 8 次平行 12 次倍比稀释 。将接种好 的平板放入铺有湿纱布的瓷盘 , 28 ℃培养 20d , 供硝化细菌计数用 。分别用格氏试剂 和二苯胺试剂判定结果 , 出现红色者 , 为亚 硝化细菌阳性者 , 出现兰色者 , 为硝化细菌 阳性者 。本实验中只要有红色或兰色出现 , 都作为硝化菌阳性 。根据出现的阳性小孔 , 查相关的 MPN 指数表 , 再换算成 1ml 污泥 样品中含硝化细菌的菌数 。 115 培养装置
会编 1 水和废水监测分析方法 1 北京 : 中国环境科学 出版社 , 1989 : 254 - 354 [6 ] 金志刚 , 屈计宁 1 硝化细菌富集技术分析及方法研究 1 上海环境科学 1998 , 8 : 16 - 19
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图 1 间歇培养装置示意图
116 指标的测定[5] 定量分析 : COD 测定 : 重铬酸钾法 ; NH4+ - N 的测定 : 钠氏比色法。
定性分析 : NH4+ - N , 采用奈氏试剂检 测 ; NO2 - , 采用格里斯试剂检测 ; NO3 - 采 用锌 - 碘 - 淀粉试剂检测 ;
2 结果与讨论 211 氨氮浓度对氨氮降解率的影响
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(MLSS) 计算出利用这两种污泥进行氨氮降 解的速率 ( K) 分别为 : K1 = 1168mg (NH4 + - N) / g (MLSS) ·h ; K2 = 1102 mg (NH4 + - N) / g (MLSS) ·h 从测定的结果看 , 两种 富集方式都具有明显的氨氮降解特性 , 这一 结果与金志刚等的实验结果有相似之处[6] , 但摇床富集培养的效果比间歇曝气培养方式
水中溶解氧的高低影响到好氧厌氧微生 物的比例 , 大多数学者认为 DO 应控制在 115 - 210mg/ L , 低于 015mg/ L 硝化作用明显 减弱 。同时在硝化过程中保持一定的泥令 , 合适的碳氮比对硝化及脱氮均有影响 。因 此 , 根据以上种种分析 , 我们控制富集培养 的环境条件为温度 28 - 30 ℃, pH710 - 815 , 底泥与培样液的比为 15 % (v/ v) , DO 大于 210mg/ L 。 114 硝化细菌的计数方法[4] 11411 样品处理
氨氮降解率大体能反映硝化细菌的活性 和数量 , 探讨氨氮浓度对氨氮降解率的影响 可以明确富集培养基中氨氮的加入量 。实验 选择摇床培养 4 周的硝化活性污泥进行 。取 6 份相同量的硝化污泥 , 经离心 , 加入培养 基 , 使培养基中 NH4 + - N 浓度分别为 5010 、 10010 、15010 、20010 、25010 、30010mg/ L , 经 28 ℃, 120rpm 摇床培养 , 24h 后取样重新 测定 NH4 + - N 浓度 , 计算出相应的氨氮降 解率 , 将结果绘制成图 (见图 2) 。
《淡水渔业》2000 年第 30 卷第 9 期
硝化细菌富集方法的研究
李 谷
黄 正 范 玮 刘红艳
(中国水产科学研究院长江水产研究所 434000) (同济医科大学环境医学研究所 430400)
在集约化养殖水体中有机物和 “三氮” 的浓度往往明显增加 , 随着有机物的增加 , 异氧微生物得以大量繁殖 , 而自养微生物如 硝化细菌由于其自身的特点 : 自养性 、好氧 性 、生长速度慢 、依附性和产酸性 , 在水体 中的数量受到相对抑制 。据调查研究表明 , 在人工控温养鳖池水体中硝化细菌的数量仅 为 13 (MPN) / ml[1] , 如此低的硝化细菌的 存在直 接 影 响 到 硝 化 效 果 和 生 物 脱 氮 的 效 率 , 容易导致 NH4 + - N 浓度升高 。一般情 况下 , 废水中硝化细菌的浓度与硝化速率成 正比 。因此 , 提高硝化细菌的浓度对降解养 殖水体中氨氮具有十分重要的意义 。目前 , 国外已有硝化细菌培养方面的技术专利 , 其 中一些已形成工业化生产 , 但产品价格较 贵 。因此 , 研究并开发经济实用的硝化细菌 富集技术 , 提高硝化细菌的产率 , 对养殖废 水中氨氮的降解尤为重要 。本文旨在通过两 种不同的方法 , 探讨了富集培养硝化细菌的 途经 , 并得到了富含硝化细菌且价格低廉的 活性污泥样品 。 1 材料和方法 111 污泥样品
取自长江水产研究所甲鱼养殖基地排污 口底泥 , 培养前用沙布去除样品中的沙粒 。 112 硝化细菌富集培养基的主要成分[2]
(NH4 ) 2SO4 5g ; MgSO4 ·7H2O 015g ; NaCl 2g ; FeSO4 ·7H2O 0104g ; MnSO4 ·4H2O
0101g ; K2HPO4 1g ; CaCO3 5g ; H2O 1000mL ; pH 712 ; 灭菌 。 113 培养条件的确定[3]
33 (3) : 675 [4 ] 王家玲主编 1 环境微生物学实验 1 北京 : 高等教育出
版社 , 1988 : 40 - 44 [5 ] 国家后步环境保护局《水和废水监测分析方法》编委
保持 pH 值 712 - 815 , 对硝化细菌的富集培 养非常重要 ; 保持适当的 COD/ N 比例 , 随 时调整培养基中的 NH4 + - N 浓度这些因素
温度对硝化细菌的生长速率和硝化速度 都有较大影响 。大多数硝化细菌的合适生长 温度为 15 - 35 ℃, 温度对硝化速率的影响 可表 示 为 , μ = μ0θ(T- 20) , 式 中 T 为 温 度 ( ℃) , θ为温度系数 。
pH 值对硝化细菌的影响多数人认为亚 硝化细菌为 710 - 815 , 硝化细菌为 615 715 , 同时 , 硝化作用伴随着产酸会使 pH 值 降低 , 因此调节 pH 值保持在适宜的范围对 硝化细菌的培养非常重要 。
培养前 硝化菌 异养菌
第4周 硝化菌 异养菌
第8周 硝化菌 异养菌
第 12 周 硝化菌 异养菌
摇床培养
13
曝气培养
13
812 ×106 812 ×106
614Leabharlann Baidu×104 417 ×104
219 ×107 312 ×107
212 ×108 416 ×107
614 ×106 218 ×106
500ml 的人工配水 , 在相同条件下曝气 , 24h 数量的比较
后采样测定氨氮浓度结果 。根据公式 Kn =
两种富集培养方式在不同培养阶段硝化
Co ( NH4 + - N ) - Ct ( NH4 + - N ) / T 1 O 细菌和异养菌数量计数结果见表 1 。
表 1 硝化细菌和异养菌数量计数结果
式 , 经 12 周的培养均获得硝化细菌占绝对 优势的硝化污泥 , 而异养菌则降到较低水 平 。计数结果硝化细菌 516 ×1010 MPN/ ml 和 419 ×109 MPN/ ml , 异养菌 713 ×103 CPU/ ml 和 811 ×103 CPU/ ml ; 同时 , 在培养过程中
[3 ] Rowe R et al1Microtechnique for Most - Probable - Number Analysis。Applied and Environmental Microboilogy , 1977 ,
取上述两种样品污泥各 1ml , 分别加入 到装有 99ml pH 为 712 的磷酸盐缓冲液的 100ml 烧杯中 , 用 CSP - 2 型超声波发生器 震荡 1min , 充分分散包埋在菌胶团中的细
3 本文为农业部重点科研项目“应用微生物改善集约化养殖水体的研究”的部分内容 。 收稿日期 :2000 - 05 - 08
采用 摇 床 培 养 和 间 歇 曝 气 培 养 两 种 方
参考文献
[1 ] 李谷 , 运珞珈 1 人工养鳖池水质的理化特征和细菌状 态的研究 1 湖北农学院学报 , 2000 , 2 : 157 - 160
[2 ] 俞毓磬主编 1 环境工程微生物检验手册 1 北京 : 中国 环境科学出版社 , 1990 : 135 - 136
ml 和 419 ×109 MPN/ ml , 而异养菌为 713 × 103 CPU/ ml 和 811 ×103 CPU/ ml ; 得到的活
学研究室王家玲教授和运珞珈副教授的悉心指导 , 特此致谢 !
性污泥中硝化细菌成为绝对优势菌种 , 采用 摇床富集培养比间歇曝气富集培养硝化细菌 数量的增加更为明显 。 3 结论
516 ×1010 419 ×109
713 ×103 811 ×103
硝化菌 MPN/ ml , 自养菌 CPU/ ml
从表 1 可以看出 , 培养 12 周后两种富 对硝化细菌的富集培养也不可忽视 。
集培养方式硝化细菌数量为 516 ×1010 MPN/
致谢 : 本研究得到同济医科大学环境微生物
更好 ; pH 值变化在摇床富集培养的硝化污
泥中也更为明显 , 基本上需要每天都进行调
图 3 有机物浓度与氨氮降解率的关系
节 , 表明硝化反应在该体系进行得更为完
213 两种富集培养方式的比较
全 。其可能的原因会不会是溶氧的差异所
分别取经过连续富集培养 6 周的污泥各 致 , 尚值得探讨 。
200ml , 离心后置于 1L 的锥形瓶中 , 再加入 214 两种富集培养方式硝化细菌和异养菌