第一章基因和基因组及基因工程的概念

30多种蛋白质 18SrRNA 50多种种蛋白 5SrRNA
28SRNA
3.蛋白质的合成机理（以原核生物为例）
➢ 肽链延伸的方向：N末端—C末端 ➢ mRNA的翻译方向：5’——3’方向 ➢ tRNA识别密码子，并转运氨基酸 ➢ 合成的起始：大肠杆菌中被翻译的第一个密码
子往往是5’端的第25个核苷酸以后，起始密 码子：AUG，偶有GUG，在上游约10个bp的地 方往往有一段富含嘌呤的序列（SD序列），它 与16SrRNA3’端互补。
2-2目的基因的高效可溶性表达
➢ 概念：不与细菌的任何蛋白或多肽融合在一起的表达 蛋白称为非融合蛋白。 这种蛋白质或者能够抵抗蛋白 酶的水解，或者是在蛋白酶缺失的条件下生成。
➢ 优点： 无需经过融合蛋白阶段，表达产物的生物学功 能也就更接近于生物体内天然蛋白质。
➢ 缺点：容易被细菌蛋白酶所破坏。 ➢ 适合：需要蛋白酶缺陷菌作为宿主菌或这改变启动子
减少酶1活性，减少 病痛酸的合成
减少酶7活性，减 少乙酸的形成
3-2 遗传改造工程菌的输氧能力，不再使贫 氧成为工程菌限制因子。因为，在一般 情况下，溶解氧是菌体生长的限制因子。
4 .宿主菌培养方面
影响重组菌表达效率的的生理代谢和培 养条件 ① 重组菌的质粒丢失倾向 ② 重组菌的能量分流现象 ③ 目的蛋白往往是异源蛋白质，会宿主菌 有危害 ④ 细胞培养过程中，会产生乙酸等抑制性 有机酸
是偶联的，也是连续进行的
④ 原核基因一般不含有内含子，在原核细胞中缺 乏真核细胞的转录后加工系统。
⑤ 原核生物基因的控制主要在转录水平，这种控 制要比对基因产物的直接控制要慢。
⑥ 在大肠杆菌mRNA的核糖体结合位点上，含有 一个转译起始密码子及同16S核糖体RNA 3， 末端碱基互补的序列，即SD序列，而真核基因 则缺乏此序列。
（三）、提高目的基因高效表达的途径
一个含有目的基因的受体细菌能否高效表达，将 取决于基因的结构特征、宿主菌、载体构建 和细胞培养等多个方面。对于原核生物的细 菌等受体来说，提高目的基因表达效率主要 从以下几个方面考虑：
1. 目的基因转录和翻译方面 2. 目的产物本身 3. 宿主菌改造方面 4. 宿主菌培养方面
➢ 合成的步骤：新进入的酰胺-tRNA结合到核糖 体上——肽链的形成——移位
➢ 合成的终止：识别终止信号： UAG，UAA， UGA
4 多肽合成后的定向加工与转译后加工
4-1 信号肽：在真核生物中，当某一种多肽 的N－末端刚开始合成不久，这种多肽 的取向就被决定，这是因为受这个N末 端的信号肽的控制。 在细菌中，也存在类似情况，新生 肽的N－末端也有一段信号肽结构，有 时也叫引导肽
强度、或者改变宿主菌的培养条件。
➢ 举例：大肠杆菌蛋白酶的合成主要依赖次黄嘌呤核苷 (lon)，因此采用lon-缺陷型菌株作受体菌，则使大肠杆 菌蛋白酶合成受阻，从而使目的基因的表达产物得到 保护
2-3目的基因的高效分泌表达
➢ 概念：目的蛋白分泌到细胞周质和目的蛋白转 运到细胞周质后再分泌到细胞外
➢ 优点：① 防止宿主菌对表达产物的降解；②有 利于蛋白质正确折叠，形成天然构象③减轻宿 主细胞代谢负荷④有利于分离
➢ 需要在质粒设计时加入一段信号肽基因
3 宿主菌改造
3-1 改造受体菌的遗传 性减少或消除乙酸的 生产。乙酸的大量累 计会严重抑制菌体生 长和目的基因的表达。
遗传工程改造途径如图
克隆酶3基因， 使反映向乙偶姻 的方向合成
4-2 多肽的修饰： ① N末端信号肽的切除 ② 二硫键的形成 ③ 线性多肽呈现出一定空间结构 ④ 多肽链的糖基化等
（二）、原核生物基因表达的特点
① 原核生物只有一种RNA聚合酶(真核细胞 有三种)识别原核细胞的启动子，催化所 有RNA的合成。
② 原核生物的表达是以操纵子为单位的。 ③ 由于原核生物无核膜，所以转录与翻译
1、目的基因转录和翻译方面
1-1启动子对表达效率的影响
影响外源DNA转录的主要因素是启动子的强弱。 启动子 是宿主细胞的RNA聚合酶转移结合并起始转录的合成 mRNA的部位。大多数外源的特别是真核细胞的启动子不 能被细菌（大肠杆菌）RNA聚合酶识别，因此必须将外源 基因置于大肠杆菌启动子控制下。
启动子的强弱必须适合，太强不利于宿主菌的正常生长 代谢，太弱则目的基因转录太少，不利于目的产物的表达。
基因工程 （三）
九、目的基因的高效表达
（一）、基因表达的基础知识 （二）、原核生物基因表达的基本特点 （三）、提高目的基因高效表达的途径 （四）、目的基因高效表达规律
（一）、基因表达的基础知识
1 概念：
1-1 以mRNA为模板的 蛋白质合成过程称为 翻译或转译
1-2 mRNA： 从DNA到 蛋白质的信息传递载 体
1-3 遗传密码：
3个碱基编码一个氨基酸，这三个碱基被 称为三联体密码或密码子
2 核糖体：合成蛋白质的“工厂” 核糖体由两个亚基构成，一个较大，一个较小 原核生物
原核生物核糖体
30S亚基
50S亚基
真核生物核糖体
40S亚基
60S亚基
21种蛋白质 16SrRNA 34种蛋白 5SrRNA
23SRNA
4—1提高工程菌的质粒稳定性
1）在质粒构建时，比如加入抗性基因，在培养中 就加入抗生素，就会抑制不含质粒的细胞比例 创造了条件
1-2 转译起始序列对翻译水平的影响
翻译水平的影响外源基因的表达的重要 因素是翻译起始区。翻译是在核糖体上 进行，SD序列对翻译是必须，而且它也 能影响到翻译的效率。
1-3 充分wenku.baidu.com虑宿主菌对密码子的偏爱性
大肠杆菌不同密码子的偏爱性问题， 将64组密码子分为强、中、弱密码子。
2 目的产物方面
2-1 目的基因不溶性的高效表达
过程：目的基因编码的真核蛋白质与宿主基因编 码的原核多肽或或其它基因编码的具有其它功能 的多肽和结合在一起，这种结合在一起的形成的 不溶性无活性的包涵体，又叫为融合蛋白。
举例：胰岛素与β-半乳糖苷酶形成包涵体 ➢ 优点：避免细菌蛋白酶破坏，提高目的基因表达
产物产量。 ➢ 缺点：需要经过溶解和复性才能获得有活性的 ➢ 适合：不需要翻译后修饰的蛋白质产物