发酵工程发酵讲义工业菌种
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发酵工程 第2章 发酵工业菌种PPT课件
lys.HCl 2.1 g/l
F6-16 (leu -, Thr -)
20.8 g/l
F9-50 (leu -, Thr -, AEC r)
33.5 g/l
42
代谢工程的定义
利用多基因重组技术有目的地对细胞代谢途径进 行修饰、改造，改变细胞特性，并与细胞基因调 控、代谢调控及生化工程相结合，为实现构建新 的代谢途径，生产特定目的产物而发展起来的一 个新的学科领域。
13
问题： 生产抗生素的微生物能不能用于生产氨基酸？
微生物（包括动、植物细胞）几乎可以生产 我们所需的一切产品，但是涉及到工业化生 产对于某一种特定的产品，只有特定的微生 物才具有大量表达的潜力。
例：礼来(Eli lilly),花了10年的时间从40万株微生 物中，发现了三种有潜力的新抗生素。
14
的菌落，然后根据液体培养测定多糖含量来筛选 高产菌。
28
放线菌的分离： 以产链霉素菌种的分离为例
（从退化菌种中筛选）
取工业发酵液（含孢子）样品1环 放入带玻璃珠的装有10ml 无菌水的小三角瓶中，摇匀
采用稀释法制平板，获取单菌落
根据高产菌的特点，选择目的菌落
筛ห้องสมุดไป่ตู้模型：形态依据
斜面保藏
高产菌恢复
放大培养，发酵液性能测试
物理：紫外，快中子
{ 诱变剂
化学：硫酸二乙酯，亚硝基胍
35
（一）、诱变剂的作用原理（略） （二）、诱变剂处理过程中几个有关的问题
化学诱变剂使用过程的安全性
亚硝酸：0.07MNa2HPO4 亚硝基胍：1MNaOH
诱变剂量的选择
诱变剂的选择 出发菌株的选择
36
（三）、诱变育种的一般步骤 (略)
发酵工程(2)第二章 工业微生物菌种的选育与扩大培养
淀粉酶活力极强，多作糖 化酶使用；具有较强的蛋白质 分解能力，可用于制造腐乳。
华根霉 ( Rhizopus chinentis )
酿酒所必须的重要霉菌，也是 酸性蛋白酶和腐乳生产中的重要菌 种。
2、毛霉 ( Mucor )
鲁氏毛霉 ( Mucor rouxianus ) 能糖化淀粉且能生成少量酒精；能产生
6、醋酸菌 (Acetobacter)
➢ 不形成芽孢，G－，好气性 ➢ 可生产醋酸.
7、棒状杆菌 (Corynebacterium) ➢ 是谷氨酸和其他氨基酸的高产菌.
8、短杆菌 (Brevibacterium)
氨基酸、核苷酸工业生产中常用的菌种，也是酶法 合成生产辅酶A的菌种.
9、黄单胞菌 (Xanthomonas)
5、假丝酵母 (Candida)
➢能形成假丝，液体培养时能 形成浮膜。 ➢可生产SCP、甘油、脂肪酶。
6、红酵母 (Rhodotorula)
➢有明显的红色或黄色色 素，很多种因生荚膜而形 成粘质状菌落。 ➢可由菌体提取大量脂肪、 -胡萝卜素。
7、棉病针孢酵母 ( Nematspora gossypii )
2、葡萄汁酵母 (Saccharomyces uvarum)
与酿酒酵母相似，主要的区别在于葡萄汁酵母能发酵 棉子糖和蜜二糖。
3、汉逊酵母 (Hansenula)
此属酵母多能产生乙酸乙酯，从而增加产品的香 味，可用于酿酒和食品工业。
4、球拟酵母 (Toruiopsis)
此属酵母有些种能产生不同比例的甘油、赤藓 糖、阿拉伯糖；有的能利用烃类生产蛋白质。
复筛 不纯 第四次平板分离
第三次菌种保藏
第四次原种斜面
初步工艺条件摸索
再复筛
华根霉 ( Rhizopus chinentis )
酿酒所必须的重要霉菌，也是 酸性蛋白酶和腐乳生产中的重要菌 种。
2、毛霉 ( Mucor )
鲁氏毛霉 ( Mucor rouxianus ) 能糖化淀粉且能生成少量酒精；能产生
6、醋酸菌 (Acetobacter)
➢ 不形成芽孢，G－，好气性 ➢ 可生产醋酸.
7、棒状杆菌 (Corynebacterium) ➢ 是谷氨酸和其他氨基酸的高产菌.
8、短杆菌 (Brevibacterium)
氨基酸、核苷酸工业生产中常用的菌种，也是酶法 合成生产辅酶A的菌种.
9、黄单胞菌 (Xanthomonas)
5、假丝酵母 (Candida)
➢能形成假丝，液体培养时能 形成浮膜。 ➢可生产SCP、甘油、脂肪酶。
6、红酵母 (Rhodotorula)
➢有明显的红色或黄色色 素，很多种因生荚膜而形 成粘质状菌落。 ➢可由菌体提取大量脂肪、 -胡萝卜素。
7、棉病针孢酵母 ( Nematspora gossypii )
2、葡萄汁酵母 (Saccharomyces uvarum)
与酿酒酵母相似，主要的区别在于葡萄汁酵母能发酵 棉子糖和蜜二糖。
3、汉逊酵母 (Hansenula)
此属酵母多能产生乙酸乙酯，从而增加产品的香 味，可用于酿酒和食品工业。
4、球拟酵母 (Toruiopsis)
此属酵母有些种能产生不同比例的甘油、赤藓 糖、阿拉伯糖；有的能利用烃类生产蛋白质。
复筛 不纯 第四次平板分离
第三次菌种保藏
第四次原种斜面
初步工艺条件摸索
再复筛
发酵工程 第二章 发酵工业微生物菌种制备原理和技术讲解
的水生环境中生长
种类：分属于子囊菌纲、担子菌纲及半知菌 类，目前已知的酵母菌有56属，大约500多种， 与其他类群比，种类要少得多。
分布：酵母菌主要分布在含糖质较高的偏酸 性环境，诸如果品、蔬菜、花蜜和植物叶子上， 特别是葡萄园和果园的土壤中，因而称为糖菌 （Sugar fungus）。
裂殖酵母
5. 担子菌——蘑菇（mushroom）
6. 藻类
许多国家已把藻类作为人类保健食品和饲料。 螺旋藻
可通过藻类将CO2转变为石油；国外还有从“藻 类农场”获得氢能的报道。
三、工业微生物的来源
根据资料直接向有关科研单位、高等院校、工 厂或菌种保藏部门索取或购买 从发酵制品中分离目的菌株 自然界中分离筛选新的微生物菌种 菌种选育：自然选育、人工诱变、原生质体融 合、基因工程改造
第一节 发酵工业常用的微生物菌种
我们的周围存在着多种多 样的微生物，它们和我们 的生活密切相关。
目前已知微生物约有10万种，分布在以下各界中：
原核生物界：例如细菌、蓝藻 真菌界：例如酵母菌 原生生物界：例如草履虫、变形虫 病毒：例如艾滋病毒、脊髓灰质炎病毒
发酵工业对菌种的要求
能在廉价培养基上迅速生长，目的代谢产物产量高 培养条件易于控制 生长速度和反应速度快，发酵周期短 满足代谢控制的要求 抗噬菌体和杂菌的能力强 遗传性状稳定，菌种不易变异退化 发酵过程产生泡沫少 对前体物质有耐受能力，不作为碳源利用 不是病原菌，不产生有害的生物活性物质
如何在后续的操作中使这种可能性实现？
从自然界中分离培养微生物是菌种选育的重要 和基础的步骤。
到目前为止，还没有一种分离培养方法能揭示 一个试样中所包含的所有微生物总数和种类。
在任一试样中所存在的微生物仅为极少数特定种 类的菌株；在工业微生物筛选过程中，应及时调 整检测方法，以与各种不同类型的生长和代谢之 微生物相适应。
种类：分属于子囊菌纲、担子菌纲及半知菌 类，目前已知的酵母菌有56属，大约500多种， 与其他类群比，种类要少得多。
分布：酵母菌主要分布在含糖质较高的偏酸 性环境，诸如果品、蔬菜、花蜜和植物叶子上， 特别是葡萄园和果园的土壤中，因而称为糖菌 （Sugar fungus）。
裂殖酵母
5. 担子菌——蘑菇（mushroom）
6. 藻类
许多国家已把藻类作为人类保健食品和饲料。 螺旋藻
可通过藻类将CO2转变为石油；国外还有从“藻 类农场”获得氢能的报道。
三、工业微生物的来源
根据资料直接向有关科研单位、高等院校、工 厂或菌种保藏部门索取或购买 从发酵制品中分离目的菌株 自然界中分离筛选新的微生物菌种 菌种选育：自然选育、人工诱变、原生质体融 合、基因工程改造
第一节 发酵工业常用的微生物菌种
我们的周围存在着多种多 样的微生物，它们和我们 的生活密切相关。
目前已知微生物约有10万种，分布在以下各界中：
原核生物界：例如细菌、蓝藻 真菌界：例如酵母菌 原生生物界：例如草履虫、变形虫 病毒：例如艾滋病毒、脊髓灰质炎病毒
发酵工业对菌种的要求
能在廉价培养基上迅速生长，目的代谢产物产量高 培养条件易于控制 生长速度和反应速度快，发酵周期短 满足代谢控制的要求 抗噬菌体和杂菌的能力强 遗传性状稳定，菌种不易变异退化 发酵过程产生泡沫少 对前体物质有耐受能力，不作为碳源利用 不是病原菌，不产生有害的生物活性物质
如何在后续的操作中使这种可能性实现？
从自然界中分离培养微生物是菌种选育的重要 和基础的步骤。
到目前为止，还没有一种分离培养方法能揭示 一个试样中所包含的所有微生物总数和种类。
在任一试样中所存在的微生物仅为极少数特定种 类的菌株；在工业微生物筛选过程中，应及时调 整检测方法，以与各种不同类型的生长和代谢之 微生物相适应。
发酵工程工业微生物的菌种选育(精选优秀)PPT
几种选育方法
一 自然选育 二 诱变育种 三 杂交育种 四 分子育种
经验育种
主要通过突变和筛选 来获得优良菌株
定向育种
主要通过DNA重组来 获得优良菌株
第一节 自 然 选 育
一、目前生产用菌种的特点： 1.多为人工诱变而来。 2.代谢调控系统失控。 3.生活力比野生菌株弱。 4.容易发生变异（自然变异）。 5.需要经常进行自然选育。
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一 诱变成功的影响因素
1、出发菌株的选择 1）出发菌株要有一定的目标产物的生产能力 2）生长繁殖快、营养要求低、产孢子多且早，对诱变剂敏 感 3）出发菌株的产量、形态、生理情况
可选择已经过诱变处理的菌株，这样的菌株对诱变剂的 敏感性相对高
2、诱变剂的使用方法
1）单一诱变处理：对野生菌株有效 2）复合诱变处理：包括同一诱变剂多次处理，两种以 上诱变剂先后分别处理和两种以上诱变剂同时或多次处 理。
• ④ 退化菌种的复壮： 如果发现 菌种的生产性能下降，就要设法使它 恢复，这便是菌种复壮工作的任务。
一、工业微生物的菌种选育的原因
1 天然菌种生产能力低 2 生长繁殖过快
二、菌种选育的目的：改良菌种的特性，使其符合工
业生产的要求
三、菌种选育内容
根据自然变异或人工诱变形成新的杂种，再按照工业 生产的要求筛选新的变种
1.异核现象—导致菌种这一微生物群体发生变异
相邻菌丝细胞吻合
异核体
孢子遗传特性和 生长速度不同
菌种遗传特性发生改变
2.自发形成具有不同基因型的 个体
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回复突变（reverse mutation)：突变体经过 第二次突变又完全或部分地恢复为原来的基因 型或表型。
发酵工业菌种概述
分离：利用分离技术得到纯种。
发酵性能测定：进行生产性能测定。这些特性包 括形态、培养特征、营养要求、生理生化特性、 发酵周期、产品品种和产量、耐受最高温度、生 长和发酵最适温度、最适pH值、提取工艺等。
二、新种分离与筛选的步骤 1. 采样
（1）采样对象
以采集土壤为主。一般园田土和耕作过的沼 泽土中，以细菌和放线菌为主，富含碳水化合物 的土壤和沼泽地中，酵母和霉菌较多，如一些野 果生长区和果园内。采样的对象也可以是植物， 腐败物品，某些水域等。
二、新种分离与筛选的步骤 3. 培养分离 尽管通过增殖培养效果显著，但还是处于微生 物的混杂生长状态。因此还必须分离，纯化。 在这—步，增殖培养的选择性控制条件还应进 一步应用，而且控制得细一点，好一点。纯种 分离的方法有划线分离法、稀释分离法。
二、新种分离与筛选的步骤 4. 筛选 这一步是采用与生产相近的培养基和培养条件， 通过三角瓶的容量进行小型发酵试验，以求得适 合于工业生产用菌种。
四、基因工程育种 基因重组育种：是运用体外 DNA 各种操作或修 改手法获得目的基因，再借助于病毒、细菌质 粒或其他载体，将目的基因转移至新的宿主细 胞并使其在新的宿主细胞系统内进行复制和表 达，或者通过细胞间的相互作用，使一个细胞 的优秀性状经其间遗传物质的交换而转移给另 —个细胞的方法。
四、基因工程育种
三、诱变育种
3. 紫外线的诱变育种
被照射的菌悬液细胞数，细菌为106个/ml 左右，霉菌孢子和酵母细胞为106～107个 /ml。由于紫外线穿透力不强，要求照射液 不要太深，约0.5～1.0cm厚，同时要用电 磁搅拌器或手工进行搅拌，使照射均匀。 由于紫外线照射后有光复活效应，所以照 射时和照射后的处理应在红灯下进行。
第二章发酵工业微生物菌种ppt课件
2019
-
7
(1) 曲霉属(Asprgillus)：曲霉种类繁多、分布 广泛，工业上利用曲霉生产各种酶制剂和有机 (2) 青霉属（Penicillium）：j既是使果实腐 酸。如米曲霉（ Asp. oryzae）用于酿酒和L败和实物变坏的有害菌，又是青霉素后葡萄 乳酸生产。制酱油用的酱油曲霉以及制造柠檬 糖酸的产生菌。 酸、草酸、葡萄糖酸和糖化酶、酸性蛋白酶、 (3) 根霉属（Rhizopus）：用于米酒、黄 果胶酶、单宁酶等的黑曲霉 (Asp. niger)。 酒生产。此外，广泛用作淀粉糖化菌、有机 酸发酵以及甾体转化等许多方面。 (4) 毛霉属（Mucor）：产生蛋白酶，有分 解大豆蛋白的能力。腐乳、酱油、转化甾族 化合物。土曲霉：衣康酸
11
连续培养菌种的筛选 比生长速率(u):每克菌体每小时增长的 菌体量.u=1/XdX/dt.
2019
-
12
比生长速率u
A B
r
2019 -
基质浓度
13
限 制 性 基 质
当进行流加时基质浓度<r 时,A菌先被洗出; 当进行流加时基质浓度>r 时,,B菌先被洗出;
培养液
固体培养法
2019 14
2.随机分离方法 （1）.抗生素产生菌筛选 试验菌的灵敏性，以及与抗生素有关的酶、 酶的抑制剂（例如棒酸）、激活剂、抗体 等建立起来的高灵敏度、专一的检测技术。 （2）.药理活性化合物的筛选 （3）.生长因子产生菌的筛选 （4）.多糖生产菌的筛选 （5）.免疫激活剂产生菌的分离
2019
-
3
(3) 乳酸菌：由糖类生成乳酸的一类细菌总称为乳 酸菌，有乳链球菌和乳酸杆菌之分，主要用来制 造乳制品。凡发酵产物中只有乳酸者，称为同型 乳酸发酵；凡发酵产物中除乳酸外还有乙酸等和 CO2者，称为异型乳酸发酵。肠膜状明串珠菌属 于乳酸菌族，是制药工业生产有旋糖酐的重要菌。 (4) 大肠杆菌：工业上利用大肠杆菌的谷氨酸 脱羧酶，进行谷氨酸定量分析。还可以利用 大肠杆菌制取天冬氨酸、苏氨酸和缬氨酸等。 医药方面用它制造治疗白血症的天冬酰胺酶。 另外，在研究细菌遗传变异方面，以及构建 基因工程菌时，大肠杆菌是理想的研究材料。
2.发酵工业菌种
二 ①施加选择性压力
、 发
压力的选择 营养、环境条件
酵
工 ②随机分离法
业
菌 种
抗生素产生菌的分离:如抑菌圈法、稀释法、
的 分
扩散法、生物自显影法
离 筛
酶抑制剂产生菌的分离 体外
选 抗病毒药物产生菌的分离 噬菌斑
发 酵 工 程 — 菌种
6.发酵性能测定
二 、
对筛选出的菌种进行生产性能测定。这些特
发 酵 工
菌 种
须非常谨慎，要避免化学诱变剂与皮肤接触，
选 育
且切勿吸入其蒸气，有人对某些诱变剂极其
常 敏感，甚至未直接接触就会过敏，这就更要
规 当心。
育
种
发 酵 工 程 — 菌种
诱变剂的选择
①碱基类似物和羟胺具有很高的特异性，但
三 、
很少使用，回复突变率高，效果不大。
优 良 菌
②亚硝酸和烷化剂应用的范围较广，造成的 遗传损伤较多。其中亚硝基胍和甲基磺酸乙
三 前体或产品的耐受力。
、 优
(4)抑制或消除产品分解酶。
良 菌 种
(5)改进菌种外泌产品的能力。 (6)消除代谢产品的反馈抑制。
选
育
发 酵 工 程 — 菌种
具体来讲，有以下途径：
㈠提高特定基因的表达水平
三 、
(1)引入强转录及翻译信号，可通过在一高效
优 良 菌
表达载体上克隆靶基因；在靶基因的上游引 入强启动子；修改现有表达信号，提高基因
二、发酵工业菌种的分离筛选
二 、
典型步骤：样品采集→样品预处理→目标菌 富集→初筛→复筛→发酵性能测试→菌种鉴
发 酵
定→菌种保藏
工
业 菌
第二章 发酵工业菌种
一些微生物的G+C含量 G-C含量（mol%） 50~52 50~53 45.5 64~67 69.5~73 66.5 64~69.5 52.5 51~54.5 29.5
2、核酸分子杂交法
DNA-DNA DNA-rRNA rRNA-rRNA 方法: 待测菌株dsDNA----ssDNA 参照菌株,同位素标记的ssDNA 检测杂合DNA的放射性强度,参照菌 株自身DNA复性的放射性强度为 100%
例：醛肟水解酶的筛选
培养基中含0.05% of Z-PAOx
每隔2-3天移去一半培养物，补充新鲜培养基
不断分析样品，2-3个月后Z-PAOx降低后，稀释分离菌落
浓度梯度法
产物合成能力与抗自身产物能力有关 有毒物质的降解能力与抗此毒物能力有关
下层加入抗性物质
上层不加入抗性物质
梯度培养皿平板制备
高浓度
1、细胞壁的化学成分 肽尾的第三位氨基酸、肽尾交联 2、全细胞水解液的主要糖型 无糖、阿拉伯糖、半乳糖、木糖等 3、磷酸类脂成分的分析 4、枝菌酸的分析 5、醌类分析
（三）数值分类法
统计分类法，生物大量表型性状的相 似形程度进行统计、归类的方法
DNA-DNA杂交同源性性>60%为同种 >70%同一亚种 20～60%为同一属
3、rRNA寡核苷酸编目分析
rRNA是细胞中的“活化石” 原核生物：23s、16s、5s 真核生物：28s、18s、5.8s 16s或18s用作系统分类：（提出三域学说） 生理功能重要又恒定、含量高易提取、核 苷酸序列保守、分子质量适中、信息量大
1、采样对象 以采集土壤为主。 根据微生物营养类型。 根据微生物的生理特性。 极端环境条件下。
《发酵工程》02 工业发酵菌种选育
（2）增殖培养
➢目的： 富集目的微生物，让目的微生物在种群中 占优势，使筛选变得可能。
富集方法 1、养分 3、培养时间
2、pH条件 4、培养温度
等一切能提高目的微生物相对生长速度的手段，培养（固体、 液体；分批连续）后使目的微生物在种群中占优势。
（３）纯种分离
•
尽管通过增殖培养效果显著，但还是处于微
真菌（青霉素、头孢等）
一些产芽孢的细菌 植物或动物来源
问题：生产抗生素的微生物能不能用于生产氨基酸？
微生物（包括动、植物细胞）几乎可以生产 我们所需的一切产品，但是涉及到工业化生 产对于某一种特定的产品，只有特定的微生 物才具有大量表达的潜力。
例： 礼来(Eli lilly),花了10年的时间从40万株微 生物中，发现了三种有潜力的新抗生素。
• 细菌（bacteria）：常用的有枯草芽孢杆菌、 醋酸杆菌、棒状杆菌、短杆菌等。
短杆菌：GA、Gln、lys…… 枯草芽孢杆菌：淀粉酶（BF7658）、碱性蛋白酶等 地衣芽孢杆菌：HASS(耐高温α-淀粉酶) αAmylase 苏云金芽孢杆菌短：杆B菌T生物农药…棒…状杆菌 梭状芽孢杆菌：丙酮、丁y酸ea等sts的发酵
啤棒酒状酵杆母菌
• 酵母菌（yeast）：属单细胞真核生物，主 要分布于含糖较多的酸性环境中。常用的 有：啤酒酵母、假丝酵母、类酵母等。
啤酒酵母：酿酒、辅酶类物质的发酵
酒香酵母：酿酒
汉逊酵母：酿酒，用于乙酸乙酯的发酵
假丝酵母：单细胞蛋白生产，石油发酵
霉菌
• 霉菌（mould）：喜偏酸性环境。可用于生产多种 酶制剂、抗生素、有机酸及甾体激素等。
黑曲霉：柠檬酸工业、酿酒业、糖化酶 黄曲霉：酱油生产，面酱 青霉菌：青霉素的生产 红曲霉：红曲制造，南方红曲酒（女儿红）；红色；豆腐 乳 赤霉菌：赤霉素的生产
发酵工程原理与技术课件
自然选育和诱变育种交替使用可获高产菌株。
•发酵工程原理与技术
•44
特殊变异菌的筛选方法
营养缺陷型突变株 抗阻遏和抗反馈突变型 组成型突变株 抗（敏感）性突变株
•发酵工程原理与技术
•47
高丝氨酸缺陷菌生产赖氨酸
必需氨基酸 食品、医药、畜牧业需要量很大 但在代谢过程中，一方面赖氨酸对天冬氨酸激酶有反馈抑制， 另一方面还同时生成苏氨酸和甲硫氨酸，使赖氨酸不能在细 胞内累积 高丝氨酸缺陷菌（不能合成高丝氨酸脱氢酶，补充适量高丝 氨酸）则合成大量赖氨酸
2
3
2
1
3 2
对照(HC0 =HC1+ HC2 + HC3) 诱变
3
•发酵工程原理与技术
( HC1＞ HC0 能力增强)
( HC2＜ HC0 能力减弱) ( HC3= HC0 能力不变)•42
•发酵工程原理与技术
•43
诱变后的突变株会继续变异，低单位菌株在传代过程 中往往占优势，因此复筛中常常出现产量高低不稳的状态， 必须进行自然分离—诱变育种和杂交育种必须环节。
•发酵工程原理与技术
•21
自然选育
自然选育：利用菌种自然突变(Spontaneous Mutation)进 行菌种筛选的过程。 自然突变：微生物在没有人工参与下所发生的突变。 引起自然突变两个原因：多因素低剂量的诱变效应和互变 异构效应。
•发酵工程原理与技术
前进
•22
自然突变
多因素低剂量诱变效应：自然突变实质上是由一些原 因不详的低剂量诱变因素引起的长期综合效应，如宇宙 空间各种短波辐射、自然界中普遍存在的一些低浓度诱 变物质以及微生物自身代谢活动中所产生的一些诱变物 质(如H2O2)的作用等。
•发酵工程原理与技术
•44
特殊变异菌的筛选方法
营养缺陷型突变株 抗阻遏和抗反馈突变型 组成型突变株 抗（敏感）性突变株
•发酵工程原理与技术
•47
高丝氨酸缺陷菌生产赖氨酸
必需氨基酸 食品、医药、畜牧业需要量很大 但在代谢过程中，一方面赖氨酸对天冬氨酸激酶有反馈抑制， 另一方面还同时生成苏氨酸和甲硫氨酸，使赖氨酸不能在细 胞内累积 高丝氨酸缺陷菌（不能合成高丝氨酸脱氢酶，补充适量高丝 氨酸）则合成大量赖氨酸
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3 2
对照(HC0 =HC1+ HC2 + HC3) 诱变
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•发酵工程原理与技术
( HC1＞ HC0 能力增强)
( HC2＜ HC0 能力减弱) ( HC3= HC0 能力不变)•42
•发酵工程原理与技术
•43
诱变后的突变株会继续变异，低单位菌株在传代过程 中往往占优势，因此复筛中常常出现产量高低不稳的状态， 必须进行自然分离—诱变育种和杂交育种必须环节。
•发酵工程原理与技术
•21
自然选育
自然选育：利用菌种自然突变(Spontaneous Mutation)进 行菌种筛选的过程。 自然突变：微生物在没有人工参与下所发生的突变。 引起自然突变两个原因：多因素低剂量的诱变效应和互变 异构效应。
•发酵工程原理与技术
前进
•22
自然突变
多因素低剂量诱变效应：自然突变实质上是由一些原 因不详的低剂量诱变因素引起的长期综合效应，如宇宙 空间各种短波辐射、自然界中普遍存在的一些低浓度诱 变物质以及微生物自身代谢活动中所产生的一些诱变物 质(如H2O2)的作用等。
第2章 发酵工业菌种
（3）诱饵法： 将一些固体物质加到待分离的土壤或 水中做成诱饵富集目的菌。 2.2.3 富集培养 利用不同微生物生长繁殖对环境和营养 的要求不同，投其所好取其所抗，使目的 菌成为人工环境下的优势菌。
（1）控制培养基的营养成分：如唯一碳源 （2）控制培养条件：如T、DO、pH、添加 抑制剂等 2.2.4 菌种分离 常用的纯培养分离方法有： （1）平板划线法 （2）稀释分离法 （3）简单平板分离法 （4）涂布分离法 （5）毛细管分离法 （6）小滴分离法
5、液氮超低温保藏法 ①方法：准备安瓿管 制备菌悬液 分装和 熔封安瓿管 冷冻 保藏 复活 ②原理：超低温，M的所有代谢活动暂时停止 ③适用范围：除少数对低温损伤敏感的M外，该 法适用各类M ④保存期限：一般可达4—15年 ⑤优点：保存期长、变异小、适用范围广 ⑥缺点：需特殊设备，液氮消耗多、操作费用 高、操作复杂
从自然界分离筛选菌种的一般步骤： 样品采集 样品预处理 富集培养 菌种分离 初筛、复筛 性能鉴定 2.2.1 样品采集 总原则是：（1） 样品来源越广，获得新菌种 的可能性越大； （2）要了解目标产物的性质和可能产目标产 物的微生物种类及其生理特征。
①了解微生物的代谢规律。如初级代谢基本 相同，但通常丝状菌及产芽孢细菌才能进 行次级代谢。 ②考虑微生物的生理特征。如营养类型、生 长环境等。
第2章
发酵工业菌种
• 在发酵工业中，工业生产水平主要由三个 要素决定，即： 1、 生产菌种性能 2、发酵及提取工艺条件 3、 生产设备 其中，生产菌种是最重要的因素，是发酵 的灵魂。
2.1 发酵工业常用菌种
一、发酵工业对菌种的要求 1 菌种不能是病源菌 2 发酵周期短，生产能力强 3 发酵过程中不产或少产与目标产物性质相 似的副产物 4 原料来源广价格低廉，菌种能高效地将原 料转化成产品 5 对需添加的前体有耐受能力，且不能将前 提作为一般碳源利用
发酵工程2发酵工业菌种
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发酵工程2发酵工业菌种
自然选育、诱变育种、抗噬菌体菌种的选育、 杂交育种、原生质体融合技术、基因工程、蛋 白质工程、代谢工程技术等都被用优良生产菌 种的选育。
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发酵工程2发酵工业菌种
菌株选育典型流程
出发菌株（砂土管或冷冻管）
原种特性考擦
斜面
或摇瓶培养24h
小试 培养基优化
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发酵工程2发酵工业菌种
3．酵母(yeast)
酵母是单细胞真核微生物,具有典型的细
胞结构,生长温度范围在4-30℃,最适温度为25-
30℃。酵母在自然界分布很广，主要生长在偏
酸性的含糖环境中。
工业上常用的包括面包酵母、酒精酵母、
啤酒酵母、葡萄酒酵母、假丝酵母、丝赤酵母
等。用于酿酒、制造面包、生产脂肪酶、单细PPT文档源自模板发酵工程2发酵工业菌种
3、富集培养 • 通过富集培养增加待分离的目标微生物的数量。 • 控制培养基的营养成分：碳源或氮源； • 控制培养条件：温度、pH、渗透压、溶解氧浓
度等。
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发酵工程2发酵工业菌种
4、菌种分离 • 平板划线分离法 • 稀释分离法 • 涂布分离法
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•常见的工业微生物： •细菌、放线菌、酵母菌、霉菌及危害细菌、 放线菌生长的噬菌体等 。
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发酵工程2发酵工业菌种
一、工业微生物常用菌种
1．细菌（bacteria ） 发酵工业常用的细菌有枯草芽孢杆菌、醋酸
杆菌、乳酸菌、棒状杆菌、短杆菌等。用于生 产酶制剂、醋酸、乳酸、氨基酸、肌苷酸等 。
纤维素酶等，它的变异菌株可产生柠檬酸、葡萄
糖酸、草酸及抗坏血酸。
发酵工程第二章工业发酵菌种-32学时
1、操作简便、高效、保藏期一般可到达15年 以上，是目前被公认的最有效的菌种长期保藏 技术之一。
2、除了少数对低温损伤敏感的微生物外，该 法适用于各种微生物菌种的保藏。
3、可使用各种培养形式的微生物进展保藏， 无论是孢子或菌体、液体培养物或固体培养物 均可采用该保藏法。
缺点：需购置超低温液氮设备，且液氮消耗较 多，操作费用较高。
菌、好氧性细菌等，对霉菌和酵母菌的保藏 效果较好。 缺点： 1、对很多厌氧性细菌的保藏效果较差， 2、不适用于某些能分解烃类的菌种。
3、冷冻〔真空〕枯燥保藏法 ***
❖简称：冻干法。用保护剂制备拟保藏菌种 的细胞悬液或孢子悬液于安瓿管中，再在 低温下快速将含菌样冻结，并减压抽真空， 使水升华将样品脱水枯燥，形成完全枯燥 的固体菌块。并在真空条件下立即融封， 造成无氧真空环境，最后置于低温下，使 微生物处于休眠状态，而得以长期保藏。
❖ 应用：酱油、酱类〔淀粉酶〕
❖ 米曲霉
❖ 应用：产糖化酶和蛋白酶、主要用于酿酒 制曲和酱油制曲
青 霉 菌
青霉菌
曲霉
黑曲霉
红曲霉
根霉
❖ 根霉： 米根霉、华根霉、少根根霉、爪哇根霉
❖ 应用：酿酒
三、工业发酵生产菌种来源 ***
❖ 1 、从自然界别离筛选
❖ 2 、从菌种保藏机构获得
❖ 3、从生产过程中已有的菌种中筛选发生正
2、矿油封藏法〔液体石蜡保藏法〕***
在无菌条件下，将灭过菌并已蒸发掉水 分的液体石蜡倒入培养成熟的菌种斜面 上，高出斜面顶端lcm，使培养物与空气 隔绝，加胶塞并用固体石蜡封口后，垂 直放在室温或4℃冰箱内保藏。保存期为 1年。
优点： 1、保存时间长，能使保藏期达1～2年。 2、操作简单，适于保藏霉菌、酵母菌、放线
2、除了少数对低温损伤敏感的微生物外，该 法适用于各种微生物菌种的保藏。
3、可使用各种培养形式的微生物进展保藏， 无论是孢子或菌体、液体培养物或固体培养物 均可采用该保藏法。
缺点：需购置超低温液氮设备，且液氮消耗较 多，操作费用较高。
菌、好氧性细菌等，对霉菌和酵母菌的保藏 效果较好。 缺点： 1、对很多厌氧性细菌的保藏效果较差， 2、不适用于某些能分解烃类的菌种。
3、冷冻〔真空〕枯燥保藏法 ***
❖简称：冻干法。用保护剂制备拟保藏菌种 的细胞悬液或孢子悬液于安瓿管中，再在 低温下快速将含菌样冻结，并减压抽真空， 使水升华将样品脱水枯燥，形成完全枯燥 的固体菌块。并在真空条件下立即融封， 造成无氧真空环境，最后置于低温下，使 微生物处于休眠状态，而得以长期保藏。
❖ 应用：酱油、酱类〔淀粉酶〕
❖ 米曲霉
❖ 应用：产糖化酶和蛋白酶、主要用于酿酒 制曲和酱油制曲
青 霉 菌
青霉菌
曲霉
黑曲霉
红曲霉
根霉
❖ 根霉： 米根霉、华根霉、少根根霉、爪哇根霉
❖ 应用：酿酒
三、工业发酵生产菌种来源 ***
❖ 1 、从自然界别离筛选
❖ 2 、从菌种保藏机构获得
❖ 3、从生产过程中已有的菌种中筛选发生正
2、矿油封藏法〔液体石蜡保藏法〕***
在无菌条件下，将灭过菌并已蒸发掉水 分的液体石蜡倒入培养成熟的菌种斜面 上，高出斜面顶端lcm，使培养物与空气 隔绝，加胶塞并用固体石蜡封口后，垂 直放在室温或4℃冰箱内保藏。保存期为 1年。
优点： 1、保存时间长，能使保藏期达1～2年。 2、操作简单，适于保藏霉菌、酵母菌、放线
【发酵工程】余龙江版-第2章-发酵工业菌种
在不同水体的水样中加入一定的底物如蔗糖、多糖及蛋白 质等，同样可以促进水中微生物的增殖。
培养过程中可加入低浓度的抗真菌剂以抑制真菌的生长。 另一富集方法是在培养烧瓶中添加细菌“附着材料”，如
无菌的植物组织或土壤浸出液。 通过改变培养温度和培养周期可选择性富集嗜冷性细菌、
中温菌和嗜高温菌。
次代培养及纯化步骤
1. 采样
(2) 采样对象
土壤、水、空气及枯枝落叶等，以土壤为主。
从土壤中采样要考虑土壤的以下特点：
① 有机质含量和通风状况
耕地、菜园 山坡上的森林
（有机质丰富、通气保水性能好）——细菌、放线菌
（有机质丰富、阴暗潮湿）——霉菌、酵母菌
沙土、无植被土壤、新开垦的生土、贫瘠的土地
——微生物少
② 取样的土层深度：5-25cm
3. 富集培养
富集培养的策略
（2）控制培养条件
➢ 溶氧浓度——好氧/厌氧 ➢ 高温——嗜热微生物 /非嗜热微生物 ➢ PH——嗜酸性/嗜碱性
4. 菌种分离
平板划线分离法 稀释分离法 毛细管分离法 小滴分离法
• 稀释倒 平板法
稀释分离法
• 平板 涂布法
注意：必须要做多个浓度的稀释分离平板。
1. 采样
③ 土壤的酸碱度
偏碱——细菌、放线菌 偏酸——霉菌、酵母菌
④ 土壤的植被状况
葡萄成熟时——根部酵母菌增多
⑤ 地理条件
南方土壤比北方土壤微生物含量多
⑤ 季节条件
秋季菜土样最理想
2.样品的预处理
（1）物理方法
热处理：根据目的菌较非目的菌的耐热性高 从而增加目的
菌的比例。
膜过滤法：浓缩水中的微生物细胞。 离心法：同上。
植物体上细菌的分离：无菌富集，加植物浸出 液适度培养取样，洗涤，取1ml经适度稀释后涂 布平板。
培养过程中可加入低浓度的抗真菌剂以抑制真菌的生长。 另一富集方法是在培养烧瓶中添加细菌“附着材料”，如
无菌的植物组织或土壤浸出液。 通过改变培养温度和培养周期可选择性富集嗜冷性细菌、
中温菌和嗜高温菌。
次代培养及纯化步骤
1. 采样
(2) 采样对象
土壤、水、空气及枯枝落叶等，以土壤为主。
从土壤中采样要考虑土壤的以下特点：
① 有机质含量和通风状况
耕地、菜园 山坡上的森林
（有机质丰富、通气保水性能好）——细菌、放线菌
（有机质丰富、阴暗潮湿）——霉菌、酵母菌
沙土、无植被土壤、新开垦的生土、贫瘠的土地
——微生物少
② 取样的土层深度：5-25cm
3. 富集培养
富集培养的策略
（2）控制培养条件
➢ 溶氧浓度——好氧/厌氧 ➢ 高温——嗜热微生物 /非嗜热微生物 ➢ PH——嗜酸性/嗜碱性
4. 菌种分离
平板划线分离法 稀释分离法 毛细管分离法 小滴分离法
• 稀释倒 平板法
稀释分离法
• 平板 涂布法
注意：必须要做多个浓度的稀释分离平板。
1. 采样
③ 土壤的酸碱度
偏碱——细菌、放线菌 偏酸——霉菌、酵母菌
④ 土壤的植被状况
葡萄成熟时——根部酵母菌增多
⑤ 地理条件
南方土壤比北方土壤微生物含量多
⑤ 季节条件
秋季菜土样最理想
2.样品的预处理
（1）物理方法
热处理：根据目的菌较非目的菌的耐热性高 从而增加目的
菌的比例。
膜过滤法：浓缩水中的微生物细胞。 离心法：同上。
植物体上细菌的分离：无菌富集，加植物浸出 液适度培养取样，洗涤，取1ml经适度稀释后涂 布平板。
《发酵工业菌种》PPT课件
物活性物质和毒素。
编辑ppt
6
（二）分离筛选原理与技术
1. 筛选的指导思想 2. 分离筛选工作在实际中应用的几个方面 3. 新种分离筛选原理与技术
编辑ppt
7
1. 筛选的两种指导思想
先分离纯化，再结合工艺要求进行筛选。 分离纯化同时富于筛选条件，一步得出所需菌株。
结果有两种可能：
▪ 获得适于工业发酵菌株 ▪ 只获得选育所需的出发菌株
选择性分离技术 富集液体培养技术 施加选择压力，进行定向筛选 固体培养技术
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17
A.富集液体培养
增加混合菌群中所需菌株数量的一种技术 技术特点：给混合菌群提供一些有利于目的菌株生长
或不利于目的菌以外的其他菌型生长的条件 培养方式
▪ 分批培养方式：以最大比生长速率 （μmax）筛选， 存在选择压力的控制、移种时间和次数等问题
随机分离技术举例
抗生素产生菌的筛选
药理活性化合物产生菌的筛选
生长因子产生菌的筛选
多糖产生菌的筛选
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22
高产培养基设计的几个原则
制备一系列的培养基，其中有各种类型的养分成为 生长限制因素；
使用一聚合或复合形式的生长限制养分； 避免使用容易同化的碳源或氮源，防止分解代谢物
阻遏； 确定含有所需的辅因子（Co2+,Mg2+,Mn2+,Fe2+）； 使用pH缓冲剂以减少pH变化； 前体、促进剂及抑制剂的采用。
编辑ppt
20
B. 固体培养技术
常用于分离某些酶产生菌 选择压力：在选择培养基中加入所需酶
的基质
编辑ppt
21
随机分离原理与技术
从产物入手，通过设计高产培养基和建立快速 灵敏专一的筛选方法，从随机分离的菌落中筛 选出所需的目的菌。
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（二）分离筛选原理与技术
1. 筛选的指导思想 2. 分离筛选工作在实际中应用的几个方面 3. 新种分离筛选原理与技术
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1. 筛选的两种指导思想
先分离纯化，再结合工艺要求进行筛选。 分离纯化同时富于筛选条件，一步得出所需菌株。
结果有两种可能：
▪ 获得适于工业发酵菌株 ▪ 只获得选育所需的出发菌株
选择性分离技术 富集液体培养技术 施加选择压力，进行定向筛选 固体培养技术
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A.富集液体培养
增加混合菌群中所需菌株数量的一种技术 技术特点：给混合菌群提供一些有利于目的菌株生长
或不利于目的菌以外的其他菌型生长的条件 培养方式
▪ 分批培养方式：以最大比生长速率 （μmax）筛选， 存在选择压力的控制、移种时间和次数等问题
随机分离技术举例
抗生素产生菌的筛选
药理活性化合物产生菌的筛选
生长因子产生菌的筛选
多糖产生菌的筛选
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高产培养基设计的几个原则
制备一系列的培养基，其中有各种类型的养分成为 生长限制因素；
使用一聚合或复合形式的生长限制养分； 避免使用容易同化的碳源或氮源，防止分解代谢物
阻遏； 确定含有所需的辅因子（Co2+,Mg2+,Mn2+,Fe2+）； 使用pH缓冲剂以减少pH变化； 前体、促进剂及抑制剂的采用。
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B. 固体培养技术
常用于分离某些酶产生菌 选择压力：在选择培养基中加入所需酶
的基质
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21
随机分离原理与技术
从产物入手，通过设计高产培养基和建立快速 灵敏专一的筛选方法，从随机分离的菌落中筛 选出所需的目的菌。
发酵工业菌种PPT课件
随机分离方法
(用筛选方案- 检测系统进行间接分离）
富集液体培养 固体培养基条件培养 (初筛)
菌种纯化
复筛
菌种纯化
初步工艺条件摸索
再复筛 生产性能测试
较优菌株1-3株
保藏及进一步做生产试验 或作为育种的出发菌株
某些必要试验和 毒性试验等
含微生物样品的采集
采样时应注意的问题: 土壤微生物的分布 采土深度 土壤植被情况 采样季节 土壤的酸碱度
.
1
本章内容
一、发酵工业菌种筛选的原则与基本技术 二、发酵工业菌种改良
.
2
一、发酵工业菌种分离筛选原则与基本技术
（一）发酵工业菌种筛选的总趋势与要求 （二）分离筛选原理与技术 （三）应用举例
.
3
1. 菌种选择的总趋势
野生菌→变异菌 自然选育→代谢控制育种 诱发基因突变→基因重组的定向育种
金黄色葡萄球菌209p 枯草杆菌6633 大肠杆菌 耻垢分枝杆菌607 白色念珠菌 青霉菌
代表微生物类型
革兰氏阳性球菌 革兰氏阳性杆菌 革兰氏阴性肠道细菌
结核杆菌 酵母状真菌 丝状真菌
药理活性化合物产生菌的筛选
药理活性化合物是指能抑制人类代谢中某一 个关键酶的微生物产物即酶抑制剂，从而达到 治疗的目的。
筛选模型：目标酶
.
26
生长因子产生菌的筛选
筛选模型：营养缺陷型试验菌 筛选方法：利用被分离的微生物产物能否促进
营养缺陷型试验菌生长
.
27
氨基酸产生菌的筛选
样品
预处理
初筛（除真菌）
在分离平板上生长获得多个单菌落 复印平板（copy 法）
平板培养，其中有产生氨基酸的菌落分泌氨基酸 u.v线杀死长好的菌落
发酵工程第二章发酵工业菌种ppt课件
样品充分混匀； 每支移液管及涂布棒只能接触 一个稀释度的菌液；
同一稀释度三个以上重复,取平 均值；
每个平板上的菌落数目合适， 便于准确计数；
①初筛
初筛是从分离得到的大量菌种中将合成目的产物的菌种筛 选出来的过程。初筛可分为两种情况进行：
a.平板筛选 对于在分离纯化阶段没有进行平板定性法挑选 出来的菌株，可以先进行平板定性筛选。在初筛时，使 用平板快速检测法，将复杂而费时的化学测定改为平板 上肉眼可见的显色或生化反应，可以减少筛选的工作量， 大幅度地提高筛选效率。
研究方法 1、模拟自然培养法：原位培养、培养条件优化、单细胞操作。
2、宏基因组分析法：测序分析未培养微生物的基因组，结合蛋白质组学， 了解其代谢途径、基因表达调控机制等。
第二节 发酵工业菌种的分离筛选
菌种的来源
根据资料直接向有科研单位、高等院校、工厂或菌种保 藏部门索取或购买；
从大自然中分离筛选新的微生物菌种。
度、碳源和氮源类型及浓度等，使目的微生
物在最适宜条件下迅速繁殖，数量增加，成
为人工环境下的优势种。
3. 富集培养
富集培养的策略 （1）控制培养基的营养成分 用促进某特定微生物生长繁殖的选择性培养基或培养条件。 可用抑制其他微生物生长繁殖的选择性培养基或培养条件。
例如碳源利用的控制，可选定糖，淀粉、纤维素，或者石油等，以其中的一种为唯一碳源，那么只有 利用这一碳源的微生物才能大量正常生长，而其它微生物就可能死亡或淘汰。这样对下阶段的纯 种分离就会顺利得多。
在科学研究中，通过菌种选育还可以了解菌种的 遗传学性质
2.1 工业发酵菌种概述
10
1
微生物物种
100 已发现物种
被利用物种
细菌