地塞米松对骨髓基质细胞生物学特性的影响

地塞米松对骨髓基质细胞生物学特性的影响
魏宽海　裴国献　郑　磊　王　前　金　丹　胡罢生
【摘　要】 目的　探讨地塞米松对体外培养的骨髓基质细胞增殖和分化等生物学特性的影响。

方法　取4～6周龄新西兰兔双侧股骨骨髓3m l,体外分离,培养至第3代骨髓基质细胞,分别用地塞松浓度为0、10-10、10-9、10-8、10-7和10-6mo l L的培养基,作用2、4及6天后,测定骨髓基质细胞的分裂增殖能力和碱性磷酸酶活性。

结果　地塞米松对骨髓基质细胞的增殖起抑制作用,并随地塞米松浓度的升高而增强,其浓度大于10-8mo l L后抑制作用越显著。

地塞米松在抑制增殖的同时,可显著增强骨髓基质细胞的碱性磷酸酶活性,浓度越高作用也越显著,但超过10-8mo l L后各浓度的作用效果无显著差别;这种作用随时间的延长而增强,至6天时与对照组相比可增强2～4倍。

结论　地塞米松抑制骨髓基质细胞的增殖,但可促进其分化为成骨细胞,浓度为10-8mo l L较合适。

【关键词】 组织工程 骨髓基质细胞 地塞米松 增殖 分化
THE EFFECTS OF D EXA M ETHAS ONE ON B I OLOGI CAL CHARACTER ISTI CS OF B ONE M ARR OW STR OM AL CELL S W E I K uan2ha i,P E I Guo2x ian,ZH EN G L ei,et a l.D ep a rt m en t of O rthop ed ics and T raum a tology,N anf ang H osp ita l,the F irst M ilita ry M ed ica l U n iversity.Guang z hou Guang d ong,P.R.Ch ina 510515
【Abstract】 Objective　To investigate the effects of dexam ethasone on the p ro liferati on and differen tiati on of bone m arrow strom al cells(M SC).M ethods　M SC w ere iso lated and cu ltu red in v itro.A fter treatm en t w ith differen t concen trati on s of dexam ethasone(0,10210,1029,1028,1027and1026mo l L),the p ro liferati on and alkaline pho sphatase(AL P)activity of M SC w ere m easu red to evaluate the effect of dexam ethasone on the b i o logical characteristics of M SC.Results　D exam ethasone inh ib ited cell p ro liferati on.W ith the increase of concen trati on of dexam ethasone,the effect w as enhanced,w h ich w as mo re sign ifican t w hen the concen trati on of dexam ethasone w as over1028mo l L.A t the sam e ti m e,dexam ethasone p romo ted the activity of AL P.T h is effect w as enhanced w ith the increase of concen trati on of dexam ethasone,bu t the alterati on w as s m all w hen the concen trati on of dexam ethasone w as over1028mo l L.T he effects increased w ith the ti m e.T he activity of AL P w as enhanced2to4 ti m es w ith the dexam ethasone fo r6days.Conclusion　D exam ethasone inhab it the p ro liferati on of M SC,w h ile induce them to differen tiate in to o steob lasts.T he app rop riate concen trati on of dexam ethasone w as10-8mo l L.
【Key words】 T issue Engineering Bone m arrow strom al cells D exam ethasone P ro liferati on D ifferen tiati on
Founda tion ite m s:N ati onal Basic Science R esearch and D evelopm en t Gran ts(973)(G1999054308);N ati onal N atu ral Science Foundati on of Ch ina(39970743)
用骨组织工程的方法修复骨缺损克服了以往方法的一些不足[1]。

骨组织工程中种子细胞的选择与培养是最基本的环节,其来源有骨、骨外膜、骨髓和骨外组织。

综合相比之下,以骨髓为最优[2]。

但骨髓基质细胞(bone m arrow strom al cells,M SC)具有多向分化潜能,为了提高其成骨效率,有必要选择合适的培养条件,以促进M SC分裂增殖并定向分化为成骨细胞。

为此设计进行实验,观察地塞米松对M SC增殖与分化特性的影响,以期建立一种理想的M SC体外培养体系。

1　材料与方法
111　主要仪器与试剂
基金项目:国家重点基础研究发展规划(973):组织工程的基本科学问题(G1999054308);国家自然科学基金资助项目(39970743)作者单位:第一军医大学南方医院创伤骨科(广州,510515) 倒置相差显微镜(O lym p u s),752紫外分光光度计(上海),B i o2rad450型酶联免疫检测仪(U SA),R PM I1640、96孔培养板(Gibco),胎牛血清(四季青生物制品公司),胰蛋白酶、T riton2100、M T T、二甲亚砜、牛血清白蛋白、考马斯亮蓝G2250 (天象人生物制品公司),地塞米松、维生素C (Sigm a),碱性磷酸酶试剂盒(南京建成生物工程研究所)。

112　方法
11211　M SC的培养　取4～6周健康新西兰大白兔,双侧股部剪毛,碘酒、酒精消毒后,用16号骨穿针自股骨大转子部穿入骨髓腔,注射器抽吸双侧股骨骨髓共3m l,混入无血清的1640培养基反复抽吸吹打。

离心、过滤网,经4号针头反复抽吸,制成单细胞悬液。

加入315m l含15%FB S的培养基,以
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3×106单个核细胞 m l 的细胞数接种入培养瓶中,
在37℃、5%CO 2及饱和湿度条件下培养,5天后半量换液,以后2～3天半量换液一次。

待细胞汇合成单层后,用0125%胰蛋白酶消化,进行传代培养,常规2～3天半量换液。

11212　细胞增殖测定　将传至第3代的细胞以5×103 孔密度接种于96孔培养板,每孔加入15%
血清培养基200Λl ,在37℃、5%CO 2及饱和湿度条件下培养。

24小时细胞完全贴壁吸去培养基,分别加入不同浓度的无血清诱导培养基200Λl ;地塞米松浓度分别为0(对照组)、10-10、10-9、10-8、10-7和10-6m o l L (实验组),每组5孔,于第2、4及6天用M T T 法分析M SC 的存活和增殖能力。

11213　细胞分化测定　细胞接种及处理同上,分别
于第2、4及6天用考马斯亮蓝法测细胞总蛋白质,检测细胞碱性磷酸酶(alkaline p ho sp hatase ,AL P )活性,计算平均每毫克蛋白质的AL P 活性。

113　统计学处理方法
使用SPSS 统计软件对数据进行方差分析。

组间t 检验,P 值<0105为有显著性差异。

2　结果
211　地塞米松对骨髓基质细胞增殖的影响
M T T 法测定不同浓度地塞米松作用后对M SC
增殖的影响结果见图1、2。

从图1可见,地塞米松抑
制M SC 的增殖,随浓度的升高而作用愈显著。

与对照组相比较,10-9m o l L 、10-8m o l L 有显著性差异(P <0105),10-7m o l L 、10-6m o l L 有非常显著性差异(P <0101)。

从图2可见,地塞米松抑制M SC 的增殖,但同一浓度的不同时间点相比,M SC 数随时间延长仍呈上升趋势(P <0101)。

212　地塞米松对骨髓基质细胞分化的影响地塞米松对M SC 分化的影响结果见图3、4。

从图3可见,地塞米松可显著增强M SC 的AL P 活性,浓度越高作用越显著,至第6天时与对照组相比可增强2～4倍。

与对照组比较,10-9m o l L 有显著性差异(P <0105),10-8、10-7和10-6m o l L 均有非常显著性差异(P <0101)。

但浓度超过10-8m o l L 后各组之间无显著差异(P >0105)。

从图4可见,同一浓度的不同时间点相比,随时间延长M SC 的AL P 活性显著增强(P <0101)。

图1　不同浓度地塞米松作用6天后对M SC 增殖的影响　图2　地塞米松10-8mol L 不同作用时间对M SC 增殖的影响　图3　不同浓度地塞米松作用6天后M SC -AL P 活性影响　图4　地塞米松10-8mol L 不同作用时间的M SC -AL P 活性影响
F ig .1　The effect on proliferation of M SC af ter treat men t with differen t concen tration s of dexamethasone for 6days F ig .2　The effect on proliferation of M SC af ter treat men t with 10-8mol L dexamethasone for 2,4and 6days F ig .3　The activ ity of AL P of M SC af ter treat men t with differen t concen tration s of dexamethasone for 6days F ig .4　The activ ity of AL P of M SC af ter treat men t with 10-8mol L
dexamethasone for 2,4and 6days
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332・中国修复重建外科杂志2001年第15卷第4期
3　讨论
将组织工程方法应用于临床修复骨缺损已成为
趋势。

组织工程学的全过程包括种子细胞的选择和培养、种子细胞和生物材料复合后联合培养、复合体植入体内三个步骤。

其中,以种子细胞的获取和培养无疑是基础和最为重要的环节。

理想的骨组织工程学种子细胞应具备下列特点:①取材容易,对机体的损伤小;②在体外培养过程中具有较强的传代繁殖能力并易定向分化为成骨细胞;③植入机体后能适应受区的环境并保持成骨活性。

目前,作为种子细胞的成骨细胞有四种来源,即骨、骨外膜、骨髓和骨外组织。

综合相比之下,以骨髓为最优[2]。

骨髓分造血和基质两大系统,其成骨能力来源于基质系统。

M SC 称作成纤维细胞集落形成单位,它具有多向分化潜能,可向成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、网状细胞和肌细胞等多方向转化[3]。

由于M SC 的多向分化性,因此有必要探索最佳的体外培养条件,从而使
M SC 多量、
稳定地向成骨细胞转化,以利于新生骨组织的产生。

而在这一过程中,物理(电、磁、电磁、力)、化学(酸碱度、离子、化学物质)和生物(激素、因子、维生素)许多因素发挥着作用,对此进行深入研究是必要的[4～6]。

我们的实验结果发现,地塞米松对M SC 的增殖起显著的抑制作用,这种作用随地塞米松浓度的升高而增强,特别是大于10-8m o l L 后其抑制作用越发显著。

地塞米松在抑制增殖的同时,可显著增强M SC 的AL P 活性,浓度越高作用也越显著,但超过10-8
m o l L 后各浓度之间的作用效果无显著差别;
地塞米松的这种促进M SC 2AL P 活性的作用在2天
后即可表现出来,并随作用时间的延长促进作用也越明显,至第6天时与对照组相比可增强2～4倍。

AL P 是成熟成骨细胞的标志性酶之一,在体外钙化中起着关键性作用,即没有AL P 活力,钙化就不会
发生,其主要机制在于AL P 能够水解有机磷酸酶,使局部PO +4浓度升高,并可破坏钙化抑制剂,从而启动钙化[7]。

地塞米松抑制M SC 的增殖,但却增强AL P 活性,促进向成骨细胞转化,是M SC 体外成骨
的必须成份。

地塞米松的这种作用是由于骨细胞是
糖皮质激素的靶细胞[8],地塞米松对其分化时的基因表达有一定的调节引导作用。

通过该实验我们认为,在骨组织工程学中M SC 体外培养时,培养基中地塞米松浓度取10-8m o l L 是适宜的,此浓度对M SC 增殖的抑制作用相对较小,并可显著增强细胞内的AL P 活性,从而促进M SC 定向分化为成骨细胞。

4　参考文献
1
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4
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Cheng SL ,Yang JW ,R ifas L ,et a l .D ifferentiati on of hum an bone m arrow o steogenic strom al cells in vitro :Induci on of the o steoblast pheno type by dexam ethasone .Endocrino logy ,1994;134(1):277
(收稿:1999212229 二次修回:2001203212)
全军第四次手外科学术会议征文通知
经全军显微外科专业委员会手外科专业组研究决定:于2002年5月16日～18日(15日报到,19日撤离)在浙江省杭州市召开全军第四次手外科学术会议,会议将讨论手外科领域基础研究及临床应用研究等方面的新进展、新业务、新技术及临床经验总结等。

望全军骨科、显微外科及手外科各界同道踊跃投稿,并将论文全文及500字摘要各一份寄青岛海军401医院全军手外科中心方光荣副主任收,邮编266071,截稿日期:2002年1月30日,会议有关事宜将另行通知。

全军显微外科专业委员会
手外科专业组
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・432・Ch inese J R eparative and R econstructive Surgery ,2001,V o l 15(4)。