环境内分泌干扰物复合效应研究进展
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基因重组酵母实验（yeast estrogen screen assay，YES）首先由 Edwin 等[9]在 1996 年提出。在重组基因酵母检测法中，将人类雌 激素受体基因(HER)、雌激素应答表达子(ERE)质粒和编码 β-半 乳糖苷酶的 Lac-Z 基因转染入酵母中，前两者组成转录因子，具
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环境与健康杂志 2011 年 1 月第 28 卷第 1 期 J Environ Health, January 2011, Vol．28, No．1
【综述】
环境内分泌干扰物复合效应研究进展
王春花 1，2，蒋萍 2，胡伟 2，王玉秋 2
1.天津市疾病预防控制中心毒理室，天津 300011；2.南开大学环境科学与工程学院
相同的混合体系中的复合效应
适用于对各组分作用途径不同的混合体系中 会低估实验结果
的复合效应；尤其适合复杂混合体系研究
可由已知化合物推测结构相似的未知化合物 是 CA 模型的变形，在毒理学复合效应研究中仅起着辅助 CA 模型的作用；
效应
结构可能与效应不一致，影响预测结果
基金项目：天津市卫生局项目（06KY02） 作者简介：王春花（1975-），女，主管医师，博士研究生，从事环境毒理学
在以往的研究中，四种复合效应模型均被引入基于 YES 的 EEDCs 复合效应研究[6，10]。通过实验及模型拟合结果的对比，发 现四种模型中 CA、IA 在较高浓度范围内两种模型的预测效果 都比较理想。而由于 CA 模型对各组分独立效应要求在重叠范 围内，故对于效应相距悬殊的 EEDCs，CA 很难胜任复合效应研 究；而 IA 模型有时会低估实验结果。另外，EEDCs 浓度过高时 会对酵母产生明显的细胞毒性，故 CA、IA 模型均不适于高浓度 复合效应预测。
Payne 等[14]采用 MCF-7 细胞增殖实验对 o，p’-DDT，p，p’DDT，p，p’-DDE 以及六六六等的二元复合效应进行了研究，结 果发现，CA 和 IA 模型均能较好地预测实验结果。Rajapakse 等[15] 同样采用该方法对雌二醇、乙基雌二醇、双酚 A、三羟基异黄酮、 4-壬基酚以及 4-辛基酚的复合效应进行了研究，结果发现，对 于大部分实验数据，CA 模型都表现出良好的拟合效果。
协同、加和、拮抗等不同类型复合效应的研究要求准确掌握 各组分基本信息，但在实际研究中却很难保证。另外，某种化学 物质所表现出的类雌激素特性可能受到其他因素的影响，比如 混合物中其他组分的性质、环境因素等，所以选取适宜的复合作 用模型将是解决上述问题的关键。
描述多元混合物的复合（联合）效应理论有很多，如效应叠 加法（effect summation，ES）、浓度加和法（concentration addition， CA）、独立作用法 （independent action，IA） 和毒性等效因子法 （toxicity equivalency factor，TEF）等[2]。各方法的基本情况列于表1。
摘要：随着环境毒理学的不断发展，低剂量复合污染问题逐渐成为研究热点。近年来，越来越多的环境内分泌干扰物 （environmental endocrine disrupting chemicals，EEDCs）进入人们视线，这类物质以其种类繁多、暴露剂量低、作用复杂等特 性引起广泛关注。该文综述了 EEDCs 复合效应的研究进展，预测了今后可能的研究方向，并提出建立我国特有的 EEDCs 检测评估体系的重要性。
另外，Heneweer 等[12]曾以 2-羟基-甲氧基苯酚等可滤过紫 外线的 EEDCs 为研究对象，通过测定 TFF1 基因的表达来评估 ER-α 的活性，结果也发现，CA 模型的拟合效果最佳。
MCF-7 细胞是一种 ER+的人类乳癌细胞，常被用于 EEDCs 研究。该细胞 ERs 受外界物质刺激后，可诱发胞内反应，分泌一 种 53 kD 的外蛋白。该蛋白的分泌受雌激素特异性调节，因此， 外蛋白的产生及其含量可用来判断受试物是否具有雌激素活性 及其活性强度[13]。
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另外，描述复合效应就要明确不同效应的分界点。目前研究 的各种 EEDCs 混合物由于性质上的相似性，往往表现出加和效 应。在毒理学中，加和效应是指不同化学物质作用在一起时产生 除相互增强或削弱以外的情形，即介于协同、拮抗效应之间的一 种复合效应。因此，只有准确描述加wenku.baidu.com效应才能界定协同、拮抗 效应。
有调节 Lac-Z 基因表达的作用。当外界物质与雌激素受体(ERs) 结合的时候，可以激活转录因子，进而使 Lac-Z 基因表达，生成 β-半乳糖苷酶，通过检测 β-半乳糖苷酶的量就可以定量检测 出化学品的类雌激素活性。由于该方法具有快速，操作简单，易 于重复等优点，为越来越多的科学家应用于 EEDCs 的复合效应 研究中。
1 环境污染物复合作用理论 早期 EEDCs 复合效应研究主要采用 1986 年美国环境保护
局（USEPA）推荐的“整体混合方法”，这种方法将混合物视为一 种物质，而对单一物质的效应不予评估。该方法适用于组分清晰 的具体案例，当实验结果需要外推至其他不同配比或组成时即 不再适用。其另一大缺点是不能明确指出复合效应的类型。
于是出现了两个用于描述加和效应的基本概念—— —浓度加 和（即 CA，通常也被称作剂量加和）以及独立反应（IA）。CA 模 型由 Kortenkamp[4]提出，可以防止因目标化合物的非线性剂量效应关系造成的结果误判。1939 年，Bliss 等提出了独立作用法 （IA），该方法主要针对各组分作用途径不完全相同的混合体系 中的复合效应。近年来，这两种方法在严格的多元化合物复合效 应研究中得到广泛应用。
2 环境内分泌干扰物复合效应研究进展 EEDCs 健康效应的评估方法通常分为流行病学调查和实
验方法两个方面，前者主要通过调查问卷获取信息，得出的结论 可能与真实效应存在偏差；后者在外推至高等生物时存在明显 的不足。实验方法主要包括化学方法和生物方法。化学方法可能 在样品预处理过程中造成有效组分的流失，从而造成结果出现 偏差；生物方法由于具有灵敏、快速、廉价等特点，成为 EEDCs 低剂量复合效应评价的重要手段[7]。
人 乳 腺 癌 MCF -7 细 胞 内 的 ER -α 基 因 报 告 系 统 曾 被 Charles 等[11]用于雌二醇、乙基雌二醇及己烯雌酚复合效应研究， 当各组分浓度落在各自剂量-效应曲线线性范围内时，实验结 果与 CA 模型预测结果基本一致；当受试物浓度较高时，由于饱 和现象导致实验结果低于 CA 模型预测结果。
关键词：环境内分泌干扰物；复合效应；低剂量暴露 中图分类号：R994.6 文献标志码：A 文章编号：文章编号：1001-5914（2011）01-0082-04
Research Advance in Joint Effects of Environmental Endocrine Disrupting Chemicals WANG Chun -hua，JIANG Ping， HU Wei，et al. Tianjin Centers for Disease Control and Pretention，Tianjin 300011，China Corresponding author：WANG Yu-qiu，E-mail：yqwang@nankai.edu.cn
复合模型 效应叠加法 浓度加和法
独立作用法 毒性等效因子法
表 1 四种污染物复合作用模型的优、缺点
优点
缺点
简便易行
在大多数情形下不够准确
可防止因目标化合物的非线性剂量-效应关 浓度较高时实验结果会低于 CA 模型预测结果；各组分独立效应要求在重
系造成的结果误判；适用于各组分作用途径 叠范围内，否则不准确
研究。 通讯作者：王玉秋，E-mail：yqwang@nankai.edu.cn
最早出现的 ES 理论有着明显的缺陷，因为独立实验效应 总和不会超过 100%，简单地将各组分效应相加得到复合效应 在大多数情形下是不准确的[3]。
环境与健康杂志 2011 年 1 月第 28 卷第 1 期 J Environ Health, January 2011, Vol．28, No．1
浓度加和模型假设参与构建模型的化学物质的生物学作用 机制是相似的，一种物质产生的效应值可以被其他组分部分或 全部取代。单一化学物质在混合物中的贡献值与各自浓度成正 比，并且认为低于检测阈值的浓度效应仍符合浓度加和假定，利 用此方法可以研究低于无观测效应浓度（NOEC）时内分泌活性 物质对整体生物学效应的影响情况。毒性等效因子法是 CA 模 型的变形，在毒理学复合效应研究中往往起着辅助 CA 模型的 作用。
Key words：Environmental endocrine disrupting chemicals；Multiple effects；Low-dose exposure
环 境 内 分 泌 干 扰 物 （environmental endocrine disrupting chemicals，EEDCs）这一概念首先是由 Colborn 等于 1993 年提出 的[1]。这类环境污染物具有种类多、数量大、暴露剂量小（ppb～ppt 级）等特点。内分泌干扰物按其生物活性可分为类雌激素及抗雌 激素、类雄激素及抗雄激素、类甲状腺素及抗甲状腺素等。这类 物质除了能干扰内分泌机能，还可引起哺乳动物的病理性损伤， 甚至造成生态失衡，影响人类和其他动物的繁衍。目前，越来越 多的化学物质被检测出具有内分泌干扰特性。大量事实表明，这 类物质在环境中表现出协同、加和、拮抗等复合效应，相关研究 引起了世界各国科学家的重视。
Abstract：As the constant progress has been made in environmental toxicology，scientists begin to pay more attention to lowdose and multi -chemicals pollutions. Environmental endocrine disrupting chemicals (EEDCs) are such pollutants which are characteristic of variety，complexity and low exposing dose. The present paper reviewed the recent researches on joint effects of EEDCs during the past two decades，predicted the further studies in this field, and also discussed the importance of establishment of detection and evaluation system which is proper in China.
1994 年之前，由于对复合毒理学研究理论的认识不够深入 以及实验方法不够成熟，导致相关复合效应的研究并不成功[8]。 笔者主要按照 EEDCs 基本分类，对于 1994 年之后有关雌激素 类物质、抗雄激素类物质以及甲状腺激素干扰物的生物实验法 复合效应研究进展进行综述。 2.1 雌激素类物质 近年来，细胞及分子水平上相关研究主要 利用受试物与雌激素反应原件（ER-α 和 ER-β）结合，进而激活 特定基因表达或引发细胞增殖。
独立作用模型假设参与构建模型的化学物质作用于生物体 不同的亚系统中，且亚阈值剂量下对复合效应没有贡献。适用于 混合体系中各组分通过不同途径发生作用的情况，因此，在复杂 混合体系中有其特殊的优越性。
CA 和 IA 模型在混合物浓度偏高时都不会出现与 ES 相似 的问题。Vighi 等[5]研究表明，对于反应模式相同的混合物，CA 模 型与实际剂量-效应曲线更为相似；而对于反应模式不同的混 合物，IA 则是更理想的预测模型。Elisabete[6]对双酚 A 等 8 种 EEDCs 进行基因重组酵母实验，所得到的复合效应剂量-效应 曲线以及不同模型拟合结果表明，CA 模型预测效果最佳。
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环境与健康杂志 2011 年 1 月第 28 卷第 1 期 J Environ Health, January 2011, Vol．28, No．1
【综述】
环境内分泌干扰物复合效应研究进展
王春花 1，2，蒋萍 2，胡伟 2，王玉秋 2
1.天津市疾病预防控制中心毒理室，天津 300011；2.南开大学环境科学与工程学院
相同的混合体系中的复合效应
适用于对各组分作用途径不同的混合体系中 会低估实验结果
的复合效应；尤其适合复杂混合体系研究
可由已知化合物推测结构相似的未知化合物 是 CA 模型的变形，在毒理学复合效应研究中仅起着辅助 CA 模型的作用；
效应
结构可能与效应不一致，影响预测结果
基金项目：天津市卫生局项目（06KY02） 作者简介：王春花（1975-），女，主管医师，博士研究生，从事环境毒理学
在以往的研究中，四种复合效应模型均被引入基于 YES 的 EEDCs 复合效应研究[6，10]。通过实验及模型拟合结果的对比，发 现四种模型中 CA、IA 在较高浓度范围内两种模型的预测效果 都比较理想。而由于 CA 模型对各组分独立效应要求在重叠范 围内，故对于效应相距悬殊的 EEDCs，CA 很难胜任复合效应研 究；而 IA 模型有时会低估实验结果。另外，EEDCs 浓度过高时 会对酵母产生明显的细胞毒性，故 CA、IA 模型均不适于高浓度 复合效应预测。
Payne 等[14]采用 MCF-7 细胞增殖实验对 o，p’-DDT，p，p’DDT，p，p’-DDE 以及六六六等的二元复合效应进行了研究，结 果发现，CA 和 IA 模型均能较好地预测实验结果。Rajapakse 等[15] 同样采用该方法对雌二醇、乙基雌二醇、双酚 A、三羟基异黄酮、 4-壬基酚以及 4-辛基酚的复合效应进行了研究，结果发现，对 于大部分实验数据，CA 模型都表现出良好的拟合效果。
协同、加和、拮抗等不同类型复合效应的研究要求准确掌握 各组分基本信息，但在实际研究中却很难保证。另外，某种化学 物质所表现出的类雌激素特性可能受到其他因素的影响，比如 混合物中其他组分的性质、环境因素等，所以选取适宜的复合作 用模型将是解决上述问题的关键。
描述多元混合物的复合（联合）效应理论有很多，如效应叠 加法（effect summation，ES）、浓度加和法（concentration addition， CA）、独立作用法 （independent action，IA） 和毒性等效因子法 （toxicity equivalency factor，TEF）等[2]。各方法的基本情况列于表1。
摘要：随着环境毒理学的不断发展，低剂量复合污染问题逐渐成为研究热点。近年来，越来越多的环境内分泌干扰物 （environmental endocrine disrupting chemicals，EEDCs）进入人们视线，这类物质以其种类繁多、暴露剂量低、作用复杂等特 性引起广泛关注。该文综述了 EEDCs 复合效应的研究进展，预测了今后可能的研究方向，并提出建立我国特有的 EEDCs 检测评估体系的重要性。
另外，Heneweer 等[12]曾以 2-羟基-甲氧基苯酚等可滤过紫 外线的 EEDCs 为研究对象，通过测定 TFF1 基因的表达来评估 ER-α 的活性，结果也发现，CA 模型的拟合效果最佳。
MCF-7 细胞是一种 ER+的人类乳癌细胞，常被用于 EEDCs 研究。该细胞 ERs 受外界物质刺激后，可诱发胞内反应，分泌一 种 53 kD 的外蛋白。该蛋白的分泌受雌激素特异性调节，因此， 外蛋白的产生及其含量可用来判断受试物是否具有雌激素活性 及其活性强度[13]。
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另外，描述复合效应就要明确不同效应的分界点。目前研究 的各种 EEDCs 混合物由于性质上的相似性，往往表现出加和效 应。在毒理学中，加和效应是指不同化学物质作用在一起时产生 除相互增强或削弱以外的情形，即介于协同、拮抗效应之间的一 种复合效应。因此，只有准确描述加wenku.baidu.com效应才能界定协同、拮抗 效应。
有调节 Lac-Z 基因表达的作用。当外界物质与雌激素受体(ERs) 结合的时候，可以激活转录因子，进而使 Lac-Z 基因表达，生成 β-半乳糖苷酶，通过检测 β-半乳糖苷酶的量就可以定量检测 出化学品的类雌激素活性。由于该方法具有快速，操作简单，易 于重复等优点，为越来越多的科学家应用于 EEDCs 的复合效应 研究中。
1 环境污染物复合作用理论 早期 EEDCs 复合效应研究主要采用 1986 年美国环境保护
局（USEPA）推荐的“整体混合方法”，这种方法将混合物视为一 种物质，而对单一物质的效应不予评估。该方法适用于组分清晰 的具体案例，当实验结果需要外推至其他不同配比或组成时即 不再适用。其另一大缺点是不能明确指出复合效应的类型。
于是出现了两个用于描述加和效应的基本概念—— —浓度加 和（即 CA，通常也被称作剂量加和）以及独立反应（IA）。CA 模 型由 Kortenkamp[4]提出，可以防止因目标化合物的非线性剂量效应关系造成的结果误判。1939 年，Bliss 等提出了独立作用法 （IA），该方法主要针对各组分作用途径不完全相同的混合体系 中的复合效应。近年来，这两种方法在严格的多元化合物复合效 应研究中得到广泛应用。
2 环境内分泌干扰物复合效应研究进展 EEDCs 健康效应的评估方法通常分为流行病学调查和实
验方法两个方面，前者主要通过调查问卷获取信息，得出的结论 可能与真实效应存在偏差；后者在外推至高等生物时存在明显 的不足。实验方法主要包括化学方法和生物方法。化学方法可能 在样品预处理过程中造成有效组分的流失，从而造成结果出现 偏差；生物方法由于具有灵敏、快速、廉价等特点，成为 EEDCs 低剂量复合效应评价的重要手段[7]。
人 乳 腺 癌 MCF -7 细 胞 内 的 ER -α 基 因 报 告 系 统 曾 被 Charles 等[11]用于雌二醇、乙基雌二醇及己烯雌酚复合效应研究， 当各组分浓度落在各自剂量-效应曲线线性范围内时，实验结 果与 CA 模型预测结果基本一致；当受试物浓度较高时，由于饱 和现象导致实验结果低于 CA 模型预测结果。
关键词：环境内分泌干扰物；复合效应；低剂量暴露 中图分类号：R994.6 文献标志码：A 文章编号：文章编号：1001-5914（2011）01-0082-04
Research Advance in Joint Effects of Environmental Endocrine Disrupting Chemicals WANG Chun -hua，JIANG Ping， HU Wei，et al. Tianjin Centers for Disease Control and Pretention，Tianjin 300011，China Corresponding author：WANG Yu-qiu，E-mail：yqwang@nankai.edu.cn
复合模型 效应叠加法 浓度加和法
独立作用法 毒性等效因子法
表 1 四种污染物复合作用模型的优、缺点
优点
缺点
简便易行
在大多数情形下不够准确
可防止因目标化合物的非线性剂量-效应关 浓度较高时实验结果会低于 CA 模型预测结果；各组分独立效应要求在重
系造成的结果误判；适用于各组分作用途径 叠范围内，否则不准确
研究。 通讯作者：王玉秋，E-mail：yqwang@nankai.edu.cn
最早出现的 ES 理论有着明显的缺陷，因为独立实验效应 总和不会超过 100%，简单地将各组分效应相加得到复合效应 在大多数情形下是不准确的[3]。
环境与健康杂志 2011 年 1 月第 28 卷第 1 期 J Environ Health, January 2011, Vol．28, No．1
浓度加和模型假设参与构建模型的化学物质的生物学作用 机制是相似的，一种物质产生的效应值可以被其他组分部分或 全部取代。单一化学物质在混合物中的贡献值与各自浓度成正 比，并且认为低于检测阈值的浓度效应仍符合浓度加和假定，利 用此方法可以研究低于无观测效应浓度（NOEC）时内分泌活性 物质对整体生物学效应的影响情况。毒性等效因子法是 CA 模 型的变形，在毒理学复合效应研究中往往起着辅助 CA 模型的 作用。
Key words：Environmental endocrine disrupting chemicals；Multiple effects；Low-dose exposure
环 境 内 分 泌 干 扰 物 （environmental endocrine disrupting chemicals，EEDCs）这一概念首先是由 Colborn 等于 1993 年提出 的[1]。这类环境污染物具有种类多、数量大、暴露剂量小（ppb～ppt 级）等特点。内分泌干扰物按其生物活性可分为类雌激素及抗雌 激素、类雄激素及抗雄激素、类甲状腺素及抗甲状腺素等。这类 物质除了能干扰内分泌机能，还可引起哺乳动物的病理性损伤， 甚至造成生态失衡，影响人类和其他动物的繁衍。目前，越来越 多的化学物质被检测出具有内分泌干扰特性。大量事实表明，这 类物质在环境中表现出协同、加和、拮抗等复合效应，相关研究 引起了世界各国科学家的重视。
Abstract：As the constant progress has been made in environmental toxicology，scientists begin to pay more attention to lowdose and multi -chemicals pollutions. Environmental endocrine disrupting chemicals (EEDCs) are such pollutants which are characteristic of variety，complexity and low exposing dose. The present paper reviewed the recent researches on joint effects of EEDCs during the past two decades，predicted the further studies in this field, and also discussed the importance of establishment of detection and evaluation system which is proper in China.
1994 年之前，由于对复合毒理学研究理论的认识不够深入 以及实验方法不够成熟，导致相关复合效应的研究并不成功[8]。 笔者主要按照 EEDCs 基本分类，对于 1994 年之后有关雌激素 类物质、抗雄激素类物质以及甲状腺激素干扰物的生物实验法 复合效应研究进展进行综述。 2.1 雌激素类物质 近年来，细胞及分子水平上相关研究主要 利用受试物与雌激素反应原件（ER-α 和 ER-β）结合，进而激活 特定基因表达或引发细胞增殖。
独立作用模型假设参与构建模型的化学物质作用于生物体 不同的亚系统中，且亚阈值剂量下对复合效应没有贡献。适用于 混合体系中各组分通过不同途径发生作用的情况，因此，在复杂 混合体系中有其特殊的优越性。
CA 和 IA 模型在混合物浓度偏高时都不会出现与 ES 相似 的问题。Vighi 等[5]研究表明，对于反应模式相同的混合物，CA 模 型与实际剂量-效应曲线更为相似；而对于反应模式不同的混 合物，IA 则是更理想的预测模型。Elisabete[6]对双酚 A 等 8 种 EEDCs 进行基因重组酵母实验，所得到的复合效应剂量-效应 曲线以及不同模型拟合结果表明，CA 模型预测效果最佳。