超氧化物歧化酶的生产

四、等电点沉淀和丙酮分级沉淀法串联结合处理
• 由图2可知丙酮分级沉淀法的最大纯化倍数仅为3 倍，而等电点沉淀法为5倍左右。 • 为寻求最佳纯化途径，我们考察，将这两种方法 合并使用的综合效果。首先将热变后的抽提液的 pH值调节至3.0，离心后再分级加入丙酮。
比活
总蛋白浓度
酶活
当丙酮加入量为1．0v／v时，处理液的SOD比活达到100u ／mg左右，即纯化倍数达到10倍，纯化效果比单步的等电 点沉淀和丙酮分级沉淀法有明显的改善。 在等电点沉淀法与丙酮分级沉淀法串联使用的工艺中，当 控制在最佳条件，即PH为3，0，丙酮加入量为1.0v／v时， 溶液中总蛋白浓度从调节PH前的4．67mg／ml下降到最终 的0．39g／ml，下降幅度达到92％，而提取液中SOD酶活 在处理前后变化都不大，只从最初50．84u／ml下降到最 终的38．30u／ml，S0D的收率达到75％以上，可见在该串 联工艺中杂蛋白的去除率还是很高的。
实验材料与方法
材料：市场新鲜大蒜头 试剂：三羟甲基氨基甲烷、邻苯三酚、丙酮、硫
酸铜、氯化钠、酒石酸钾钠，氢氧化钠等化学试 剂都为分析纯级；标准蛋白采用上海生化试剂产 生产的牛血清蛋白；
方法：将大蒜去皮榨汁，加入石英砂研磨破壁，
用0.5mol/LNaCl溶液于4℃下浸泡过夜，然后高速 离心除杂，制成SOD提抽原液。通过热变、等电点、 丙酮分级沉淀或硫酸铵盐析等方法处理后，测定 处理液的SOD酶活及总蛋白浓度的变化以考察SOD 收率和纯化效果。
大蒜SOD的应用及开发前景：
在化妆品方面，可利用SOD抗氧化、防衰老的特效， 研制大蒜美容水、美容霜、护肤霜等； 在食品方面，大蒜SOD可作为保健食品的功能因子 或食品营养强化剂，如大蒜酒、天然大蒜饮料、 SOD酸牛乳等；大蒜SOD还可作为抗氧化剂有效防 止罐头、果汁等食品的变质及腐败现象； 在医药方面，大蒜SOD是抗衰老、抗炎症和自身免 疫疾病患者广泛应用的药品或药物原料，大蒜SOD 作为牙膏的添加剂，能预防和治疗牙周疾病；大 蒜SOD无抗体干扰，有望在降血脂、治疗癌症、防 御放射性伤害等方面起到重要作用。
说明大部分杂蛋白的等电点都小于4．0， 在此范围内调整PH不会纯化SOD，只会使大 部分杂蛋白沉淀，而SOD仍留存在溶液中。
三、丙酮分级沉淀法
原理：在蛋向质溶液中加入一些弱极性有机溶剂
改变溶液的介电常数，可使不同种类的蛋白质的 溶解度产生不同程度的下降，因此该法可用来纯 化蛋白质。但有机溶剂大多都带有一定的毒性， 易使蛋白质构象发生变化而导致变性，所以在纯 化过程中一般采用毒性较小的丙酮以尽量消除这 种副作用。
在实际工业中要想得到高纯度的SOD精 品，一般都需借助层析法；但层析法 处理量小，运作成本很高，因此在使 用层析法制备精品之前先依据一些操 作简便、成本低廉的纯化方法进行精 品的制备是很有必要的。
分析方法：
SOD酶活用邻三酚自氧化法测定。SOD酶活 性单位的定义为;在1ml反应液中，每分钟 抑制邻苯三酚自氧化速率50%时的酶量为一 个活性单位。 总蛋白浓度采用双缩脲法测定。由于硫酸 铵盐析处理时铵离子的存在对双缩脲法有 干扰，因此对该步的总蛋白浓度采用紫外 吸收法测定。
一般传统工业方法的S0D收率只能达到60％，从这一点来 看我们采用的纯化方法在经济上也较为有利的．
五、酸铵盐析法

原理：
在高浓度的电解质盐溶液内蛋白质分子表面的 水化层被破坏，使蛋白质分子中的憎水区域裸露 而导致蛋白质分子聚集沉淀。硫酸铵由于价廉、 溶解度大，且能使蛋白质性质保持稳定而成为最 常用的盐析剂。 考虑到前面的实验结果，我们考察了等电点沉 淀法和盐析法综合使用的处理效果(图4)。


结论
在实际工业中要想得到高纯度的SOD精品，一般都 需借助层析法；但层析法处理量小，运作成本很高， 因此在使用层析法制备精品之前先依据一些操作简 便、成本低廉的纯化方法进行精品的制备是很有必 要的。
步骤：
① 大蒜SOD抽提液先经热变一等电点沉淀一丙酮分级沉淀三法 合用得到10倍以上的纯化效果，去除其中大部分杂蛋白。 ② 然后在所得纯化液中加入l.2——1.4v/v的丙酮使SOD全部沉 淀下来，离心收集沉淀物。 ③ 最后重新悬浮于少量缓冲溶液中就可进行下一步的层析分离 以制备精品。
一．热变性法
原理：依据SOD的热稳定性原理设计的。
SOD的热稳定性高，当温度低于60℃时，短 时间的热处理不会使酶活力有明显的变化， 而一般的杂蛋白却在温度高于55℃时就易 变性沉淀，因此，对大蒜粗提液进行短时 间的热处理可以达到去除杂蛋白的目的。 因此，我们可以考虑对大蒜抽提液进行 短时间的热击处理以达到去除杂蛋白的目 的。
表1是对大蒜抽提液在60℃热击15分钟的结果
分析：1、总蛋白浓度由原来的6.29mg/ml下降到4.67mg/ml。
2、SOD酶活却没有明显的变化。 3、SOD比活增大。
说明：总蛋白浓度的下降体现了一些杂蛋白的去除，显然，热
变性法并不能大幅度提高SOD的比活，只能作为一种很初步 的纯化手段，但该法操法十分简便，且不需加入其它试剂， 因此热变性法仍不失为工业上一种常用的纯化SOD的方法。
图2为在经热变后的大蒜抽提液中丙酮加入量为0.4～1.2v/v 时的处理结果
图2为在经热变后的大蒜抽提液中丙酮加入量为0.4～1.2v/v时的结果
酶活
总蛋白浓度
比活
处理结果：
当丙酮加入量达到1.0v/v时，SOD比活达到最高，再 加入丙酮将导致SOD酶活急剧下降，因此当以去杂蛋 白为目的时，丙酮的加入量不宜超过1.0v／v。 由图2可知丙酮分级沉淀法的最大纯化倍数仅为3倍。
பைடு நூலகம்
二、等电点沉淀法
原理：
蛋白质作为一种两性物质存在着等 电点，当溶液的pH处理某蛋白质的等电 点时，该蛋白质在溶液中的静电荷为零， 溶解度最小。由于大多数植物蛋白的等 电点都处在酸性或弱酸性范围，我们考 察了溶液pH值在2．5～7．0范围内的处 理情况(图1)。
比 活
酶活
总蛋白浓度
分析与说明
当pH2．5——4．0时，总蛋白浓度很低，较初始 4 .67mg／ml下降了80％左右，表明大部分蛋白质都变性 沉淀下来。 等电点沉淀法的最大纯化倍数为5倍左右。 由于SOD酶活较初值50.84u／ml 下降降幅度较低，仅30 ％左右，因此可以推断出变性沉淀的多为杂蛋白。 在pH值为3.0时SOD比活达到最高，此时纯化效果最好。 PH大于4．0后，总蛋白浓度逐渐恢复到初始水平。
比活
总蛋白浓度 酶活

当硫酸铵饱和度达到80％时，纯化效果最佳，但 纯化倍数显然低于等电点沉淀法和丙酮分级沉淀法， 只达到6倍左右。 盐析法和有机溶剂分级沉淀法比较而言，一般认 为盐析法更有利于保持蛋白质的生理活性，但分辨率 却不如后者。但我们前面的实验结果表明丙酮法分级 沉淀法的SOD收率还略高于盐析法.(硫酸铵饱和度80％ 时SOD酶活为35 .26u／ml，略低于丙酮沉淀法的 38 .20u／ml) 因此对于大蒜SOD的纯化而言，热变一等电点沉 淀一丙酮分级沉淀三种方法的联合使用能得到最佳的 纯化效果。
植物细胞产酶
——从大蒜细胞中分离纯化超氧化 物歧化酶
SOD简介及工业生产局限
超氧化物歧化酶（SOD)，是一种广泛存在于动物、 植物和好氧微生物细胞中的金属酶，能够催化超氧 阴离子自由基02-发生歧化反应，平衡机体代谢过 程中产生的过多自由基，减轻或消除自由基对机体 的危害，具有抗衰老、免疫调节、抑制肿瘤、调节 血脂、抗辐射、消炎和美容等功效。 国内外市场上已出现SOD产品供不应求的趋势。 SOD的提取多以动物血为原料，但由于原料来源有 限，满足不了市场的需要，因而从植物特别是无污 染天然野生植物中提取SOD，逐渐成为科学界关注 的方向。大蒜SOD与动物SOD性质相近，但前者原料 来源更为广泛，取材便利，生产成本低，并符合生 态可持续发展的要求。