第3章 载体

二、启动子探针型表达载体
三、RNAi载体
RNAi：双链RNA对基因表达的阻断作用被称为RNA干扰（RNA interference，RNAi），属于基因转录后沉默。
1. RNAi的作用机制
2. RNAi载体
1) 转基因RNAi载体
单链RNA自我配对形成发卡结构RNA，发 卡结构RNA具有引发RNAi的双链DNA
2.6kb
3 代表性λ 噬菌体
(1) 插入型载体
装载容量为：0-10.18kb
(2) 置换型噬菌体载体载体
克隆外源DNA片段范围为：9-23kb
（二） M13 噬菌体载体
1.M13噬菌体的增值 M13噬菌体是单链丝状噬菌体； 长6407bp，
507bp基因间隔区，含复制起始位点，同时可用于改造；
Cosmid载体 包装范围为36.4~51kb
质粒DNA(E.Coli-ori，MCS，筛选标记等）
cosmid可以进行有效包装和转导受体细胞，但由于不含
有λ噬菌体溶菌和溶原生长途径，故不会产生子代噬菌体。
cosmid（6.5kb）载体的装载容量：29.9~44.5kb
（二） 噬菌粒载体
噬菌体DNA间隔区（含M13 ori，颗粒形态发生所需的全部序列）； 质粒所含的ori，筛选标记，多克隆位点
（2）表达方式包括组成型表达、诱导型表达、融合型表达、分泌型表达。 组成型表达：持续不断地表达目的蛋白。 诱导型表达：在诱导物存在的情况下表达目的蛋白。
融合型表达：表达载体的多克隆位点上有一个融合表达表达标签，
表达的蛋白为融合蛋白。
分泌型表达：在起始密码和目的基因之间加入一个信号肽，可以引导目的
蛋白穿越细胞膜，分泌到细胞外。。
2) VIGS载体
VIGS：病毒诱导的基因沉默（virus induced gene silencing, VIGS) 原理：利用植物体内天然的免疫系统机制，将目的基因片段构建到病毒载体中并用 病毒浸染寄主植物，目的基因片段作物病毒的一部分同病毒一起复制并扩散到整株 植物，植物体的防御机制并病毒激活后，在识别病毒和目的基因的同时，将内源的 目的基因的mRNA降解
（二） 酵母表达载体
（三） Ti质粒表达载体
1.天然Ti质粒的结构及其致瘤功能 Ti （tumor inducing plasmid）质粒是根癌农杆菌中可引发植物产生冠 瘿瘤的致瘤； 大小为200-250kb； Ti 质粒可分为4个功能区：T-DNA、Vir、Con、Ori T-DNA区：Ti质粒中能够转移到植物细胞内的区域，称为T-DNA 即 transfer DNA
第三章
载体
载体：能够携带外源基因（或DNA片段）进入细胞复制、 整合或表达的工具称为载体（Vector）
克隆载体 表达载体
第一节 克隆载体
克隆载体：用于携带DNA片段进入宿主细胞进行复制或保存的载体 克隆载体必备条件： ① 具有对受体细胞的可转移性，能携带外源基因进入宿主细胞； ② 能在宿主细胞中自主复制，或整合到宿主基因组中随其一起复 制， 实现外源基因的增殖； ③ 具有由单一限制性内切酶识别位点组成的多克隆位点，可供外源基因 插入； ④ 具有合适的选择标记，用于含有重组载体的宿主细胞筛选。
绝大多数的质粒是DNA型的；
绝大多数的天然DNA质粒具有共价、封闭、环状的分子结构，即cccDNA； 质粒的分子范围：1-200kb。
野生型的质粒DNA上往往携带一个或多个遗传标记基因，这使得 寄主生物产生正常生长非必需的附加性状，包括： 物质抗性 抗生素、重金属离子、毒性阴离子、有机物； 物质合成 抗生素、细菌毒素、有机碱。
（三）常用的质粒载体
1. pBR322质粒载体
2. pUC18和pUC19质粒载体
3. TA载体
二、噬菌体载体
（一） λ 噬菌体载体 1 λ 噬菌体的性质 外壳蛋白 λ噬菌体 λDNA 5’端含12bp的黏性末端 线性，全长48502bp
2 λ 噬菌体的构建 构建λ 噬菌体的依据：
a.λ 噬菌体能够包装原λDNA长度的75%－105%的DNA片段 （36.4~51kb） b.有20kb的区域对λ噬菌体生长非必需。
（一）基因定点插入/基因敲除载体
外源基因与靶基因组DNA具有同源序列
同源重组
外源基因定点整合到基因组的特定位点
（二）随机插入突变载体
1. T-DNA插入突变载体
T-DNA插入破坏 插入位点的基因
2. 转座子插入突变载体
来源于苏云金芽孢杆菌的转座子Tn5401构建 用于微生物的插入突变载体pEG922
三、大片段表达载体
（一）TAC - 可转移人工染色体
（二）MAC – 哺乳动物人工染色体
哺乳动物染色体复 制起始位点序列、 端粒、着丝粒 载体元件
MAC优点：
1) 装载外源DNA片段的容量大；
ຫໍສະໝຸດ Baidu
MAC
2) 不整合到宿主染色体上；
3) 较少发生基因沉默现象。
第三节 特殊用途的载体
一、插入或定点整合突变载体
双链闭环DNA
1-2拷贝/细胞 在大肠杆菌染色体中含30个以上随机整合位点
2 细菌人工染色体(BAC)
第二节 表达载体
表达载体：是指可携带DNA片段进入宿主细胞进行复制并进行转录、
翻译的载体
用于基因表达的载体的类型：
质粒表达载体 病毒表达载体 人工染色体表达载体
一、质粒表达载体
质粒表达载体：质粒克隆载体＋启动子＋转录终止子＋核糖体结合位点
2. Ti质粒表达载体 一元载体：指含目的基因的中间表达载体和改造后的受体（Ti质粒）通过 同源重组所产生的一种复合型载体，也称为共整合载体。
双元载体：指由两个分别含有T-DNA和Vir区的相容性突变Ti质粒构成的 系统。 双元载体的特点： a.大肠杆菌和农杆菌穿梭载体；
b.可用基因枪或农杆菌介导进行遗传转化；
（一） 杆状病毒表达载体
无脊椎动物病毒，其遗传物质为双链闭合环状DNA
（二） 腺病毒表达载体
（三） 反转录病毒载体
单链RNA病毒 ↓ RNA反转录为双链DNA
↓
整合到宿主基因组构成原病毒
↓ 原病毒转录成病毒RNA，实现复制
（四） SV40型病毒转化载体
SV40是猿猴空泡病毒40，哺乳动物病毒。 SV40为双链闭环DNA病毒，可用于构建哺乳动物表达载体。
用于基因克隆的载体的类型：
质粒载体（plasmid vector） 噬菌体载体（phage vector） 考斯质粒（cosmid vector） 人造染色体载体（artificial chromosome）
一、质粒载体
质粒是生物细胞内固有的、能独立于寄主染色体而自主复制、并被稳定遗传
的一类核酸分子； 质粒常见于原核细菌和真菌中；
λ 噬菌体载体的改造：
①切除非必需区段，保证构建的λ噬菌体载不小于36.4kb， 插入或替换外源基因后不大于51kb； ②在λDNA分子的合适区域插入可供筛选的标记基因： cI基因失活、Spi筛选、Lac蓝白斑筛选 ③建立重组 λDNA分子的体外包装系统。
体外合成噬菌体外壳蛋白D和E。
4.9kb 5.5kb 该λ 噬菌体载体的最大装载容量为: 4.9+5.5+2.6+(51-48.5)=15.5kb
这些标记基因对DNA重组分子的筛选具有重要意义。
(一) 质粒的基本性状 1. 复制
质粒能利用寄主细胞的DNA复制系统自主复制； 根据寄主每个细胞内分子数（拷贝数）多少，质粒可分为两大复制 类型：
严谨型：1-9拷贝
松弛型：10个以上
2. 质粒的不相容性
定义：指两种质粒在同一宿主细胞中不能共存的现象。 通常含有相同或相似复制子的质粒具有不相容性。
M13 DNA在宿主细胞中以双链或单链形式存在，但释放到细胞外的 M13 噬菌体颗粒以单链形式存在。
2.M13噬菌体载体 1) 插入选择标记基因； 2) 组装合适的多克隆位点。
三、噬菌体-质粒杂合载体
（一） 黏粒载体
噬菌体载体：承载容量大，但本身不能包装和增殖
质粒载体：易转化易复制，但承载外源DNA片段的容量小 λDNA两端约280bp序列＋包装相关序列
（一） 原核表达载体
1.原核表达载体的表达元件 （1）表达元件主要包括启动子、转录终止子和核糖体结合位点。 启动子：位于转录起始点上游，并且为转录起始所必需的序列元件。 原核表达载体启动子种类： Lac、trp、Tac、T7和IPL启动子
转录终止子：基因编码区下游一段使转录终止的核苷酸序列。
SD序列：原核生物结构基因起始密码子上游与核糖体30S亚基识别和 结合的位点，称为核糖体结合序列即SD序列。
c.转化效率高于一元转化载体。
（四） 动物质粒表达载体
特点： a.质粒载体
b.原核复制区和选择标记基因；
c.动物细胞的选择标记基因。
二、病毒表达载体
病毒表达载体元件： a.源于病毒的启动子和增强子； b.病毒复制子序列以及所需的反式作用因子编码基因； c.polyA加尾信号。 病毒表达载体作用： a.外源蛋白的真核表达； b.基因治疗； c.多价、多联活载体疫苗的研制； d.基因功能鉴定。
四、人工染色体及其应用
定义：利用染色体的复制元件来驱动外源DNA片段复制的载体
称为人工染色体。
优点：装载容量大。 缺点：拷贝数少，制备困难 常用的人工染色体： 酵母人工染色体（yeast artifical chromosome，YAC) 细菌人工染色体（bacterial artifical chromosome，BAC）
3. 质粒的转移性
接合型质粒：能在天然条件下自发地从一个细胞转移到另一个细胞 （接合作用），如F质粒等；
非接合型质粒：不能在天然条件下独立地发生接合作用。
用于构建基因克隆载体的质粒一般是非接合质粒。
（二）质粒载体的构建
天然质粒载体不易直接作为克隆载体，需要改造： （1）选择合适的复制起始位点，松散型质粒复制起始位点； （2）加入合适的选择标记基因，主要有LacZ基因和抗生素抗性基因； （3）增加或减少酶切位点，组装多个单一的限制酶切位点即多克隆位点 （MCS); （4）缩短长度，通常重组DNA分子越小，转化效率越高。
（一） 酵母人工染色体 1 酵母人工染色体的复制元件和标记基因
酵母染色体DNA端粒 DNA复制起始点 着丝粒 选择标记
2 YAC载体的应用
主要用于基因组文库的构建，容量为：250-400kb
连接产物转化酵母菌，在尿嘧啶和色氨酸缺乏的培养基上筛选红色菌落
（二） 细菌人工染色体 1 F质粒
特点： F因子是一个约100kb的性质粒