4个近交系小鼠SNP位点的测定_胡培丽

2006年5月第16卷　第5期

中国比较医学杂志

CHINESE J OURNAL OF COMPAR ATIVE MEDICINE May ,2006Vol .16　No .5

研究报告

4个近交系小鼠SNP 位点的测定

胡培丽,范昌发,岳秉飞,邢瑞昌

(中国药品生物制品检定所,北京　100050)

【摘要】　目的　将新近建立的单管双向等位基因专一性扩增(single _tube bi _d irectional allele specific amplification ,SB _ASA )方法用于分析国内近交系小鼠基因组中的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphis m ,SNP )。方法　以国内4个近交系小鼠为研究对象,采用SB _ASA 方法对其16个SNP 位点进行检测,并通过测序进行验证。结果　16个SNP 位点,SB _ASA 都成功地对4个品系小鼠进行了分型,与测序结果完全一致。结论　SB _ASA 方法可以准确地检测国内近交系小鼠SNP 位点等位基因型。

【关键词】　单核苷酸多态性;单管双向等位基因专一性扩增;小鼠;近交系;遗传检测【中图分类号】Q78 【文献标识码】A 【文章编号】1671-7856(2006)05-0278-03

Monitoring the S NP Loci of 4Inbred Mice

HU Pei _li ,FAN Chang _fa ,YUE Bing _fei ,XING Rui _chang

(National Institute for the Control of Pharmaceutical and Biological Products ,Beijing 100050,China )

【Abstract 】　Objective T o analyse S NP (s ingle n ucleotide polymorp his m )loci of the domestic inbred mouse gen e by the lately establis hed method (single _tube bi _directional allele specific amplification (SB _ASA )).Method Four domestic inbred mouse strains were detected by 16SNP loci with the method of SB _ASA ,and seq uencing was designed to validate the reliab ility of the method .Results SB _AS A was successfully used to type 4inbred mous e strains for 16SNP loci ,and th e res ults were completely consistent with s equencin g .C onclusion SB _ASA could be us ed to exactly inspect genotype of the domes tic in bred mous e .

【Key words 】　Single nucleotide polymorphis m ;Single _tube bi _directional allele specific amplification ;Mouse ;Inbred ;Genetic monitoring

[基金项目]北京实验动物法制管理与科技支撑平台(编号:Z0004100040691)。

[作者简介]胡培丽(1981-),女,硕士研究生,研究方向:免疫遗传检测。E _mail :hupeili -1981@ [通迅作者]岳秉飞(1960-),男,研究员,博士。研究方向:动物遗传学。E _mail :yue _bingfei @nicpbp .org .cn

自从Jenson 等于上世纪初应用一个闭锁繁育的

小白鼠品系成功地进行了肿瘤转移试验以来,近交系实验动物在医学研究(特别是肿瘤研究)中显示了潜在的价值。尔后,关于培育近交系动物的理论及实践工作得到了较快的发展。高度近交系实验动物能为生物学、医学及农业科研工作提供敏感、特异性

强和重复性好的试验材料[1]

。

目前,已培育出了大量的小鼠、大鼠、地鼠、豚鼠、家兔、鸡等实验动物的近交系。在我国,随着生物科学的发展,培育大量的、具有各种特殊用途的、符合遗传质量标准近交系实验动物,满足科学研究的需要,已经刻不容缓。对于近交系小鼠,在从国外不断引进的同时,我国也先后培育出一些具有一定

特征的品系,并逐步应用于各个科学领域。

近交系小鼠具有同基因性、长期遗传稳定性、均一性、个体性、背景资料和数据较完善等特点,随着生命科学的不断发展,对其遗传品质要求越来越高。传统的小鼠遗传检测方法有形态学方法、免疫学方法、生物化学方法

[2-3]

。随着一系列分子遗传标记

的发现,产生了分子生物学检测方法,应用于实验动物遗传检测,如基于限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism ,RFLP )[4]

、随机引物多态性(Random a mplified polymorphic DNA ,

RAPD )[5-7]、微卫星(Microsatellite )[8-11]

和DNA 指纹(DNA Fingerprints )[12-13]

等。近来单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism ,SNP )技术也被用于

近交系小鼠遗传质量检测,并建立了近交系小鼠的SNP数据库[14];但目前国内主要采用皮肤移植法和生化标志基因检测方法,因此国内培育的近交系小鼠的遗传背景也只是生化标志基因方面。我们最近建立了单管双向等位基因专一性扩增(single_tube bi_directional allele specific amplification,SB_ASA)方法,用于检测SNP位点[15],本文旨在用SB_ASA方法检测国内近交系小鼠,确定SNP位点等位基因型,从而为国内近交系小鼠的SNP数据库填补空白。

1　材料与方法

1.1　样品

采用酚:氯仿抽提法从鼠尾中提取了NCPC2、NCPC4、TA1、615等4个近交系小鼠品系DNA,所有品系均引自北京国家啮齿类实验动物种子中心,经遗传生化位点检测为合格的近交系小鼠。

1.2　试剂

DNA片段纯化试剂盒、限制型内切酶Ec o RI、DNA聚合酶等PCR试剂购自宝生物公司(大连), pGE M_T Easy Vector System购自Promega公司。

1.3　SB_ASA检测方法

针对每个SNP位点,设计4个引物P1、MSP1、MSP2和P2进行PCR扩增,P1和MSP2、MSP1和P2分别扩出长度相差100bp以上的特征片段,而P1和P2在所有品系小鼠中扩增出一条可作为内对照的长片段。根据特征片段长度的差异,我们可以很容易地判断出各品系小鼠的SNP位点等位基因型。我们已经成功地建立了25μL PCR反应体系及其程序,PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳,结果在紫外灯下照相记录,用生物电泳成像系统分析,根据凝胶上电泳条带判断SNP类型[15]。

1.4　测序验证

用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收纯化目的片段,然后连接于pGE M_T Easy Vector,转化DH5α感受态细胞,涂布在有氨苄抗性的固体培养基中,过夜培养,挑单克隆摇菌过夜培养,提取质粒,Ec o RⅠ酶切验证,菌液送大连宝生物公司测序。

2　结果

2.1　SNP检测结果

对16个SNP位点进行了检测,虽然某些位点引物二聚体、错配杂带现象仍存在,但是不影响SNP 检测结果。通过琼脂糖凝胶电泳图谱(图1)可以看出,每个位点都扩增出3条目的片段,即一条所有品系都有的片段,由引物P1、P2扩增而得,起内对照的作用;两条特征片段,分别对应于不同的等位基因,根据特征片段的差异,可以很容易地确定每个品系的SNP位点等位基因。通过对多个SNP位点的检测,可以建立每个小鼠品系的SNP位点等位基因图谱,为各小鼠品系的遗传鉴定和品系间的鉴别提供了有利的实验数据,从而为近交系小鼠遗传检测提供了更加准确的遗传背景资料,表1为本实验检测的4个近交系小鼠16个SNP位点的等位基因型

。

图1　SNP位点检测结果

Fig.1　Results of the detection of SNP loci

注:A:M22381_169_2,513bp为内对照片段,419bp对应于等位基因C,132bp对应于等位基因T;B:M_09526_2,403bp为内对照片段,320bp对应于等位基因T,127bp对应于等位基因G;M:D L Marker2000;1_4:NCPC2、N CPC4、TA1、615。

Note:A:M22381_169_2,513bp is the control fragment,419bp l abels allele C,132bp labels allele T;B:M_09526_2,403bp is the control fragment,320 bp labels allele T,127bp labels allele G;M:DL Marker2000;1_4:NCPC2、NCPC4、TA1、615.