三种常见大豆制品中转基因成分检测技术的研究

中山大学
硕士学位论文
三种常见大豆制品中转基因成分检测技术的研究
姓名：姚晓庆
申请学位级别：硕士
专业：食品安全生物学
指导教师：张文庆
20070604
中山大学硕士学位论交
图１．１１９９６－－－２００６：全球转基因作物种值面积
图１－２２００６年全球４种转基因作物种植面积比例图
据ＩＳＡＡＡ主席、创始人及年度报告作者ＣｌｉｖｅＪａｍｅｓ的估计，在今后十年的商业化过程中。

种植范围将继续加速增长。

ＩＳＡＡＡ预计，到２０２５年将有４０多个国家的２０００多万农户种植２亿公顷的转基因作物。

经济和环境方面的优势促进了转基因作物在全球的广泛增长。

２００６年，各主要大陆都有一些关键的增长中心，为转基因作物在今后十年的增长奠定了广泛而稳定的基础。

丽且，该报告指出，去年有２２个国家种植了转基因作物，但另外还有２９个国家已经批准了转基因作物的进口，以用做食物、饲料，或是将它们释放到环境中。

我国的转基因植物的研究开始与上世纪八十年代初，在１９８６年８６３计划实施以后。

其发展步伐大大加快。

我国已经开展了棉花，水稻、小麦、玉米和大豆等方面的转基
２
蠕晓庆三种常见大豆制品中转基因成分检测技术的研究
ＴａｑＭａｎ探针法是高度特异的定量ＰＣＲ技术，其核心是利用１细酶的３ｒ．—５’外切核酸酶活性，切断探针，产生荧光信号．由于探针与模板是特异性结合，所以荧光信号的强弱就代表了模板的数量．
在ＴａｑＭａｎ探针法的定量ＰＣＲ反应体系中，包括一对ＰＣＲ弓ｌ物和一条探针。

探针只与模板特异性地结合，其结合位点在两条引物之间。

探针的５’端标记有报告基团（Ｒｅｐｏｒｔｅｒ，Ｒ），如ＦＡＭ，ＶＩＣ等。

３’端标记有荧光淬灭基团（Ｑｕｅｎｃｈｅｒ，Ｑ），如ＴＡＭＲＡ等。

当探针完整的时候，报告基团所发射的荧光能量被淬灭基团吸收，仪器检测不到信号。

随着ＰＣＲ的进行，Ｔａｑ酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针，其３ｒ＂·５’外切核酸酶活性就会将探针切断，报告基团远离淬灭基团，其能量不能被吸收，即产生荧光信号（图１．３）．所以，每经过一个ＰＣＲ循环，荧光信号也和目的片段一样，有一个同步指数增长的过程。

信号的强度就代表了模板ＤＮＡ的拷贝数。

圈１－３ＴＩｑＭａｎ探针的荧光信号产生机制
（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｎｂｌｏｇｓ．ｃｏｍ／ｚｅｏａ２／ａｒｔｉｃｌｅｓ／２９２４０８．ｈｔｍＢ
ＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩ荧光染料技术原理：ＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩ是一种只与ＤＮＡ双链结合的荧光染料。

当它与ＤＮＡ双链结合时，发出荧光；从ＤＮＡ双链上释放出来时，荧光信号急剧减弱（图１．４）。

因此，在一个体系内，其信号强度代表了双链ＤＮＡ分子的数量。

ＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩ荧光染料法定量ＰＣＲ的基本过程是：ｌ、开始反应，当ＳＹＢＲＧｌ＿ｅｃｎＩ染料与ＤＮＡ双链结合时发出荧光。

２、ＤＮＡ变性时，ＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩ染料释放出来，荧光急剧减少。

３、在聚合延伸过程中，引物退火并形成ＰＣＲ产物。

４、聚合完成后，ＳＹｌ｝ＲＧｒｅｅｎＩ染料与双链产物结合，定量ＰＣＲ系统检测到荧光的净增量加大。

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图１－４ＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩ荧光染料与ＤＮＡ双链的结合
（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｎｂｌｏｇｓ．ｃｏｍ／ｘｅｏｎ２／ａｒｔｉｃｌｅｓ／２９２４０８．ｈｔｍｌ）
ＳＹＢＲＧｒｅｅｎ【荧光染料能与所有的ＤＮＡ双链相结合．对ＤＮＡ模板没有选择性．所以特异性不如ＴａｑＭａｎ探针。

要想用荧光染料法得蛩ｊ比较好的定量结果，对ＰＣＲ弓ｌ物设计的特异性和ＰＣＲ反应的质量要求就比较高。

但在此前提下，本法是一种成本低廉的选择。

（２）优点、不足和局限性
Ｒｅａｌ．ｔｉｍｅＰＣＲ的优点在于：丑线性动力学范围在５．７个数量级；ｂ．适于高通量和常规分析；ｃ．检测灵敏度高（检测灵敏度至少是ＱＣ－ＰＣＲ的ＩＯ倍，可以检测到每克样品含有２ｐｇ的转基因成份（ＶａｉｔｉｌｉｎｇｏｍｅｔａＬ，１９９９）；ｄ．通过对一个内源基因进行定量可以进行相对定量；ｅ．无需对ＰＣＲ产物进行分析；ｅ大大减少了ＰＣＲ后污染的机会：ｇ．文献中有关应用的报导增长迅速。

该方法的不足之处在于：乱仪器设备的价格高；ｂ．计算取决于对效率的估计；ｃ．信号间的关系是线性一对数关系。

Ｃ。

值和Ｎｏ之间的线性一对数信号关系意味着：Ｃ。

值的微小的变化会导致预测Ｎ０时相对很大的变化（当Ｅ＝Ｉ，Ｃ。

习。

士ｌ％时，预测Ｎ０的变化大约为士２０％）。

１．３．２转基因产品的蛋白检测技术
外源基因转入植物后其表达产物是蛋白质。

转基因植物中的某些选择标记基因如ｇｕｓ（ｆｌ－ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅｇｅｎｅ）ｔｌｕｃ（１ｅＨｃ’，ｅｒｉｎａｓｅｇｅｎｅ）·印ＨＫｎｅｏｍｙｃｉｎｐｈｏｓｐｈｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｇｅｎｅ）
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图２－１试剂盒法提取豆制品ＤＮＡ
Ｍ：ＤＮＡ分子Ｍａｋｅｒ
ｌ豆粉ＤＮＡ
２酱油ＤＮＡ
３豆油ＤＮＡ
２．２．１．２用ＣＴＡＢ法提取豆制品ＤＮＡ的结果
同时提取豆粉、酱油、豆油三种样品ＤＮＡ。

通过对提取ＤＮＡ测ＯＤ值。

下表ｆ见表２．５）显示对所测样品测的ＯＤ２６０／２８０的结果。

豆粉ＯＤ２６０／２８０的比值稍大于１．８，说明样品中尚有少量ＲＮＡ残余。

可能是ＲＮＡ酶处理时间不足造成的。

酱油和豆油样品的ＯＤ２６０／２８０比值小于１．８，说明样品中仍有少量的蛋白质未被除去。

经电泳检测（图２－２）所提ＤＮＡ主带较为明显，但点群孔污染较为严重，说明杂质处理得效果不是很好。

同时也有降解．需迸一步优化。

表２－５ＣＴＡＢ法提取豆制品ＤＮＡ的ＯＤ值
瞒晓庆三种常见大豆制品中转基因成分检测技术的研究
图２－２ＣｒＡＢ法提取豆制品ＤＮＡ
Ｍ：ＤＮＡ分子Ｍａｋｃｒ
１０豆粉ＤＮＡ
ｎ酱油ＤＮＡ
１２豆油ＤＮＡ
２．２．１．３用改良法提取豆制品ＤＮＡ的结果
经过对不同样品提取ＤＮＡ方法的优化得出：豆粉和酱油用针对各自提取的改良法，豆油用试剂盒法。

这三种制品又根据其不同的加工过程有不同的预处理步骤。

将提取ＤＮＡ测０Ｄ值，下表（表２－６）显示对所测样品测的ＯＤ２６０，２８０的结果。

三种样品的ｏＤ２６０，２８０比值都十分接近１．８，说明提取效果好，经电泳检测（图２．３）豆粉和酱油所提的ＤＮＡ有明显的主带，而豆油因为加工过程复杂对大豆ＤＮＡ降解较为严重所以条带不是很明显，且杂质不能很好地去除。

但此方法相比之下较为温和，对基因组ＤＮＡ产生的各种剪切力比较小。

主带大小在２０ｋｂ左右，适合作下一步的试验。

表２－６优化方法提取豆制品ＤＮＡ的ＯＤ值
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图２－３各种改良的方法提取ＤＮＡ
Ｍ：ＤＮＡ分子Ｍａｋｅｒ
１．３豆粉ＤＮＡ（改良ＣＴＡＢ法Ｉ）
４石豆油ＤＮＡ（改良试剂盒法）
７－９酱油ＤＮＡ（改良ＣＴＡＢ法ＩＩ）
２．２．１．４分析
（１）采取针对不同豆制品改良的方法所提的豆制品中大豆基因组ＤＮＡ，效果相对而言有明显提高，从图２．３可以看出豆粉和酱油的提取效率较高，电泳检测主带明显，且无杂质污染．ＤＮＡ降解也不是很明显；而豆油由于加工过程的复杂性，提取效率较低，主带不明显，而且有明显的蛋白杂质污染，但较之前两种未改良的方法而言还是有所提高的。

（２）通过测ＯＤ值，改良法所提的基因组ＤＮＡ，ＯＤ２６０／２８０比值接近Ｉ．８．说明所提的ＤＮＡ已经比较纯，几乎无蛋白质或ＩＬＮＡ污染；而用试剂盒法和ＣＴＡＢ法所提基因组ＤＮＡ，ＯＤ２６０／２８０比值或大于１．８或小于１．８．说明有ＲＮＡ或蛋白质污染。

（３）提取植物ＤＮＡ常用的试剂主要是ＣＴＡＢ和ＳＤＳ。

ＣＴＡＢ和ＳＤＳ部可以破坏植物细胞膜，以利于细胞内容物的释放。

此外，ＣＴＡＢ可与核酸结合成复合物，有利于将ＤＮＡ与变性蛋白质及多糖分开；ＳＤＳ可与蛋白质、多糖等形成复合物，经离，ＩＩ，与ＤＮＡ分开（Ｍａｎｎｅｌｌｉｅｔａｌ．，２００３）。

大豆制品中含有丰富的蛋白质，有些是脂溶性蛋白，有些是水溶性蛋白。

有些蛋白与ＤＮＡ结合，单独用上述任何一种方法部很难较完全的去除蛋白质。

因此将两种方法结合起来．用ＣＴＡＢ来结合ＤＮＡ，用ＳＤＳ来结合蛋白，在通过酚／氯仿来将蛋白质变性除去，达到纯化ＤＮＡ的目的。

（４）在ＤＮＡ提取缓冲液中加入ＥＤＴＡ，可以鳌合Ｍｇ”，使核酸酶失活。

（５）在提取缓冲液中加入２００ｍＭ的ＮａＣｌ溶液，是为了ＤＮＡ更好的溶解，因为ＤＮＡ易溶与稀盐溶液。

（６）ＰＶＰ和抗坏血酸是防止ＤＮＡ的氧化。

我们在提ＤＮＡ时经常发生ＤＮＡ氧化变色，这会影响下一步的试验效果。

（７）盐酸胍通过离子问的相互作用，可破坏蛋白间的氢键而使蛋白增溶，使下一
图２．４豆制品四重ＰＥＲ检测结果
Ｍ：ＤＮＡ分予Ｍａｋｅｆｆ０２０００）
ｌ转基因大豆阳性对照：
２，１豆粉样品ＤＮＡ的扩增片段
４．５酱油样品ＤＮＡ的扩增片段
６．７豆油样品ＤＮＡ的扩增片段
８非转基因大豆阴性对照
ａ．ｂ．ｃ．ｄ分别为ｌｅｃ．ＮＯＳ。

ｅｐｓ．３５Ｓ引
物扩增产物对应的条带
【３】割胶回收四重引物各自扩增的片段。

将它们连接到Ｔ载体中，通过转化大肠杆菌，筛选得到阳性克隆，测序。

得到的序列经过通过ＮＣＢＩ中Ｂｌａｓｔ，完全正确，扩增的目的片段即为我们所预期的片段。

２．２．２．３分析
本实验成功创建了三种大豆加工产品四重ＰＣＲ转基因检测的体系和方法。

电泳结果（图２－４）显示所设计的四重ＰＣＲ引物合理并且适用于该检测方法，图中四条目的基因片段大小与预期片段大小一致，经测序后结果显示即为我们所扩得目的基因片段。

图中所示四条目的条带之间分隔明显．且条带清晰，证明此检测方法可行．本实验所创建的新型检测方法方便快捷，一次ＰＣＲ即可同时检测四种基因（内源和三种外源基因），大大节省了检测时间和资源。

同时提高了检测结果的可靠性，降低了假阳性结果的出现率。

２．２．３实时荧光定量ＰＣＲ检测结果
随着转基因标签制度的实施，对转基因产品检测的要求不仅是要能够给出是或否的定性检测结果，更要能够对食品中的转基因成分进行精确定量，因此定量ＰＣＲ检测技术正日渐成为转基因产品检测的热点问题。

本章利用荧光染料ＳＹＢＲＧｐ∞ｎＩ对转基因大豆加工产品的定量ＰＣＲ检测进行研究。

４ｌ
姚晓庆三种常见大豆制品中转基因成分检铡技术的研究（２）定量ＰＣＲ检测的标准曲线
【ｌ】转基因抗草苷膦大豆内源基因ｌｅｃｔｉｎ标准曲线制作如下：
表２－７转基因大豆定量标准品内源／ｅｃｔ／ｎ基因检测结果
选取其中较好的四个点作标准曲线如下：
ｃｏｎｃ＝１０“（－０．２７６×Ｃｔ＋５．８７２）相关系数Ｒ２＝Ｏ．９６２６
图２－５大豆内源／ｅｃｔ／ｎ基因的标准曲线
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【２】转基因抗草苷膦大豆外源基因ＣａＭＶ３５Ｓ标准曲线制作如下：
表２．７转基因大豆定量标准品外源ＣａＭＶ３５Ｓ基因检测结果
选取其中较好的四个点作标准曲线如下；
ｃｏｎｃ＝ｌＯ＾（．０．２６５×Ｃｔ＋５．９３０）相关系数Ｒ２＝０．９７７４
图２－６大豆外源ＣａＭＶ３５Ｓ基因的标准曲线。