生化第一题

【临床意义】
1.酸性磷酸酶（ACP）是作用类似ALP的磷酸酶（最适 pH在7.0以下），存在于人体不同组织，如前列腺、红细 胞、血小板、肾脏、肝脏、脾脏、胃、肌肉及骨髓等，主 要存在于细胞的溶酶体中，以前列腺含量最多。正常男性 血清中ACP有1/3～1/2来自前列腺，其余部分及女子血清 中的ACP可能来自血小板、红细胞、白细胞及破骨细胞等。 2.ACP测定主要用于诊断前列腺癌。前列腺癌时血清 ACP活力显著升高，转移性患者升高更加显著。 3．急性尿潴留、变形性骨炎、癌肿骨转移及甲亢时 ACP可轻度升高。此外，慢性粒细胞性白血病时，ACP同工 酶中的前列腺ACP(PAP）增高，而戈谢病、尼曼匹克病、 网状内皮细胞白血病或毛细胞白血病均为非PAP增高。是 否为抗酒石酸盐的非PAP增高为毛细胞性白血病的重要鉴 别要点。
NADH在340nm处有特征吸收峰，连续监测NADH消耗引起的 340nm吸光度变化,根据340nm处吸光度下降速率（－△A/min） 计算ALT活性
（二）定时比色法（两点法）
国内采用的比色测定法有三种： 赖氏法（30min） 金氏法（60min） 改良穆氏法（30min） 三种方法的原理、试剂、操作步骤和酶作用温度 都相似，单位定义和标准曲线绘制方法有差异。
以苄胺为底物，在O2和H2O参与下，MAO催化生成苄醛、NH3和 H2O2，产生的NH3再在谷氨酸脱氢酶催化下，与α-酮戊二酸 和NADH反应，生成谷氨酸和NAD+。在340nm波长下监测NADH吸 光度的下降速率，即可计算出MAO活力。
醛苯腙法
底物苄胺在MAO作用下氧化生成苄醛，苄醛与2，4-二硝基苯肼 反应生成醛苯腙，在碱性溶液中呈红棕色，在470nm比色测定。
Badson改良法
• ACP催化α-萘基磷酸盐，在pH4.5~6.0的条件 下释放无机磷酸盐。产物α-萘酚则偶联有色 的偶氮试剂，通过在450nm处监测偶氮化合 物生成的速率来测定ACP的活性。 • 反应式： ACP（pH5.3）
α-磷酸萘酚 + H2O α-萘酚 + 磷酸
α-萘酚 +
固红TR
重氮色素
在最佳条件下进行，反应中丙酮酸生成量与ALT活性不能呈现良好的线性关系 (这是赖氏法的最大缺陷)，其标准曲线不呈直线而为抛物线。
血清天冬氨酸氨基转移酶（AST）活性测定
[测定方法]
一、速率法（连续监测法 ） 参考方法
AST L 门冬氨酸 酮戊二酸 L 谷氨酸 L 草酰乙酸
Gomori硝酸铅法
• 原理：在酸性条件下，以β-甘油磷酸钠为底 物，由酸性磷酸酶(acid phosphatase, ACP)催 化水解释放出磷酸，磷酸与硝酸铅结合形 成无色的磷酸铅沉淀，经硫化胺处理形成 棕黑色的硫化铅沉淀。
• 优点：具有检测成本低、设备简单、准确度高、 重现性好和适合大批量样品等优良特性。
α-淀粉酶
淀粉
葡萄糖 + 麦芽糖 + 糊精 兰色复合物
+
碘液
血清脂肪酶（LPS）活性测定
• 脂肪酶(Lipase，LPS) 是胰腺外分泌酶。
LPS可被巯基化合物、胆汁酸、Ca2+及辅脂
肪酶等激活剂激活，而被重金属、丝氨酸
所抑制。血清中LPS主要来自胰腺，少量来
自胃肠粘膜。
[测定方法]
比浊法（以橄榄油悬液为底物），以连续监测 -酮戊二酸
血清碱性磷酸酶（ALP）活性测定
[测定方法]
一、速率法 原理
以对-硝基苯酚磷酸钠（PNPP）为底物， AMP或二乙 醇胺（DEA）为磷酸酰基的受体。在碱性条件下，ALP催 化PNPP水解释放出磷酸基团，生成游离对-硝基酚（pnitrophenol, PNP），PNP在碱性溶液中转变成醌式结 构，呈现较深的黄色。根据405nm处吸光度增加的速率 （△A/min）推算出血清ALP活性单位。
L 草酰乙酸 NADH H MD L 苹果酸 NAD
NADH在340nm处有特征吸收峰，连续监测NADH消耗引起的 340nm吸光度变化,根据340nm处吸光度下降速率（－△A/min） 计算AST活性
（二）赖氏比色法
AST ↔ 草酰乙酸 + L-谷氨酸 自发↓脱羧 丙酮酸
一、速率法 原理
以L-γ-谷氨酰-3-羧基-4-硝基苯胺为底物，双甘肽为谷氨酰基的 受体，在GGT的催化下，谷氨酰基转移到双甘肽分子上，同时释放 出黄色的2-硝基-5-氨基苯甲酸，根据405nm处吸光度增加的速率 （△A/min）推算出GGT活性单位
二、重氮反应比色法 原理
以γ-谷氨酰α-萘胺作为γ-谷氨酰基的供体，双 甘肽作为受体，在GGT作用下，产生α-萘胺，后者与重 氮试剂反应，产生红色α-萘胺-对-偶氮苯磺酸，其色 泽的深浅与GGT活力成正比。
血清乳酸脱氢酶（LDH）活性测定
[测定方法]
目前根据LDH催化反应方向的不同，有两大类测LD方法： 以丙酮酸为底物（反应方向PL）的逆向反应(称LD-P法) 以乳酸为底物（反应方向LP）的顺向反应(称LD-L法) 我国多采用目前IFCC参考方法LD-L法，用连续监测法进行 测定。
一、乳酸为底物的速率法（LD-L法） 原理
Cu(II)-浴酮灵法
• 原理：在酸性条件下，L-抗坏血酸-2-磷酸在 酸性磷酸酶(acid phosphatase, ACP)的催化作 用下水解生成抗坏血酸，其将水溶性的 Cu(II)-浴酮灵络合物还原成Cu(I)-浴酮灵络合 物，检测液由无色转变成橙红色，且在 484nm处有很强的吸收峰。
• 优点：具有检测成本低、设备简单、操作简便、分析速度快、 准确度高、重现性好和适合大批量样品等优良特性： • 1）所用比色探针制备过程极其简单，化学性质相当稳定，水溶 性好，生物相容性好，可在室温环境下长期保存； • 2）采用该方法，上样、反应、检测一步完成，只需一步操作即 可实现对样品中ACP活性的高灵敏、高选择性检测，检测结果 具有高度可重现性，且不易产生“假阳性”结果； • 3）检测周期短，检测成本低廉，样品消耗量少，无需复杂仪器； • 4）此外，检测体系抗干扰能力强，可直接用于临床血清样品中 ACP活性的简便、快速、高灵敏和高选择性检测。
一、EPS法 原理
对硝基苯酚生成量在一定范围内与AMY活性成比，在 405nm可以进行连续监测即可测出AMY的活性。
方法评价： 试剂稳定，水解产物确定，化学计量关系明确，
是最常用的AMS测定方法，也是IFCC的推荐方法。
二、碘-淀粉比色法 原理
血清(尿)中α-淀粉酶催化淀粉分子中α-1，4-糖苷键水解，产 生葡萄糖、麦芽糖及含有α-1，6-糖苷键支链的糊精。在底物充 分（已知浓度）的条件下，反应后加入碘液与未被水解的淀粉结 合，生成蓝色复合物，其蓝色的深浅与未经酶促反应的空白管 (此处亦相当于标准管)比较，从而推算出AMS的活力单位。
• 本学期临床生化实验所做的ACP测定使用的 是什么方法？ • 除此以外酶测定还可用哪些方法？ • 临床常用的血清酶是用什么方法检测的 （请举例说明）？
ACP
• 酸性磷酸酶(acid phosphatase , ACP ) • 【参考范围】 速率法：<11U/L。 【影响因素】 1．防止标本溶血，因红细胞中含有大量ACP。 2．标本不宜抗凝，抗凝剂可抑制ACP活性，使结果 偏低。 3．黄疸标本可使测定结果偏低。 4.ACP稳定性差，温度高于37℃及pH>7.0时很快失活， 因此高热患者不能准确测定ACP。
• 缺点：灵敏度低、选择性差、抗干扰能力不足、 操作复杂；由于临床样品（如全血）中的复杂 组分会对检测结果造成干扰，因此只能用于成 分相对简单而显色又不易受到干扰的体系，检 测前都需要对样品进行离心分离等预处理，并 不能直接用于分析实际血液样品。
磷酸苯二钠法
• 原理：在酸性条件下，酸性磷酸酶(acid phosphatase, ACP)分解磷酸苯二钠产生游离 酚和磷酸，酚在碱性溶液中与4-氨基安替比 林(AAP)作用，经铁氰化钾氧化形成红色醌 类化合物，其颜色深浅与ACP活性成正比。
• 优点：具有检测成本低、设备简单、准确度高、 重现性好和适合大批量样品等优良特性。
• 缺点：灵敏度低、选择性差、抗干扰能力不足、 操作复杂；由于临床样品（如全血）中的复杂 组分会对检测结果造成干扰，因此只能用于成 分相对简单而显色又不易受到干扰的体系，检 测前都需要对样品进行离心分离等预处理，并 不能直接用于分析实际血液样品

赖氏比色法 原理：
丙氨酸 +α-酮戊二酸
ALT
37°pH7.4
丙酮酸 + 谷氨酸
2,4-二硝 基苯肼 丙酮酸苯腙 α-酮戊二酸苯腙 (在碱性条件下呈红棕色) (在碱性条件下呈红棕色) 选择在500-520nm处检测，丙酮酸苯腙的显色强度约为α-酮戊二酸苯腙的3倍 必须降低底物α-酮戊二酸及2,4-二硝基苯肼的浓度 ALT测定不是
方法学评价
• Badson改良法属于连续监测法，但需要两 步才能完成。α-萘酚 重氮盐的反应在很短 时间内就能完成，显色的速度仅受α-萘酚产 生的速率限制。ACP性质极不稳定，血清室 温下放置2.5小时ACP活力即可下降10%左右。 每毫升血清中加入20uL5mmol/L的醋酸缓冲 液做稳定剂，在4摄氏度可稳定三天左右。
分光光度法： 酶偶联显色比色法（多用 1,2- 甘油二酯为 底物） 采用人工合成底物 1,2- 二月桂基 -rac- 丙三 氧基 -3-戊二酸试灵酯设计的连续监测法。 此法为一步速率法，具有简便、快速、灵 敏、稳定和抗干扰能力强等特点。
血清单胺氧化酶（MAO）活性测定
[测定方法]
速率法
NaOH
丙酮酸 + NADH + H+ 丙酮酸-二硝基苯腙 + H2O
血清乳酸脱氢酶同工酶测定
临床常用血清酶活性测定
氨基转移酶活性测定
血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）活性测定
一、速率法（连续监测法 ） 参考方法 原理
ALT L 丙氨酸 酮戊二酸 L 谷氨酸 L 丙酮酸
L 丙酮酸 NADH H LD L 乳酸 NAD
血清淀粉酶（AMS/AMY）活性测定
[测定方法]
天然淀粉底物方法： 碘-淀粉比色法 （分子组成）确定底物方法：
• 目前应用最多的方法是以人工合成的麦芽多糖为底物的 方法
• 如2-氯-对硝基苯麦芽三糖苷（CNP-G3）和亚乙基封闭 的对硝基苯麦芽庚糖苷法（亦称EPS法），以后者最常用， 也是IFCC的推荐方法。
二、比色法 原理
乳酸脱氢酶在有辅酶I(NAD+)存在的情况下，催化乳酸脱 氢生成丙酮酸。丙酮酸与2，4-二硝基苯肼反应，生成丙 酮酸-二硝基苯腙，在碱性溶液中呈棕红色。其颜色深浅 与丙酮酸浓度成正比，同样处理丙酮酸标准液进行比色， 即可求得LDH的活力单位。反应式如下：
LDH 乳酸 + NAD+ 丙酮酸 + 2，4-二硝基苯肼
对硝基苯磷酸二钠（pNPP）法
• 原理：在酸性条件下，pNPP在酸性磷酸酶 (acid phosphatase, ACP)的催化作用下水解生 成对硝基苯酚，其在碱性条件下脱质子化 产物在405 nm处有很强的光吸收，检测液 呈黄色。
• 优点：具有检测成本低、设备简单、分析速度快、 准确度高、重现性好和适合大批量样品等优良特性。 • 缺点：灵敏度低、选择性差、操作复杂、抗干扰能 力不足；由于pNPP溶液不稳定，易导致假阳性结果； 由于临床样品（如全血）中的复杂组分会对检测结 果造成干扰，因此只能用于成分相对简单而显色又 不易受到干扰的体系，检测前都需要对样品进行离 心分离等预处理，并不能直接用于分析实际血液样 品。 •
PNPP AMP PNP AMP Pi
ALP
二、金氏比色法 原理
在pHl0的碱性条件下，ALP催化磷酸苯二钠底物水解， 生成游离的酚和磷酸氢二钠。酚在碱性溶液中与4-氨 基安替比林结合，并经铁氰化钾氧化生成红色的醌类 衍生物，根据红色深浅计算出ALP活力的大小。
血清γ-谷氨酰转移酶（GGT）活性测定 [测定方法]